子宫内膜异位症相关慢性盆腔痛患者子宫在位内膜PGP 9.5表达的临床意义

罗 燕，罗明燕

(江西省妇幼保健院生殖健康科，南昌 330006)

子宫内膜异位症相关慢性盆腔痛患者子宫在位内膜PGP 9.5表达的临床意义

罗 燕，罗明燕

(江西省妇幼保健院生殖健康科，南昌 330006)

目的研究蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)在子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)患者在位内膜功能层的表达及其与慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)的关系，探讨神经纤维(PGP 95的表达)在EMs相关CPP中的作用以及GnRHa药物对其治疗效果。方法对40例行手术治疗的EMs患者(EMs组)和40例同期手术的育龄期妇女(对照组)采用免疫组织化学SP法，检测子宫在位内膜功能层中PGP 9.5的表达。通过视觉模拟评分法(VAS)对EMs患者进行CPP程度及手术分期(rAFS)评定，并采用Spearman法分析两者与PGP 9.5的相关性。对EMs患者促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)治疗前后在位内膜PGP 9.5表达情况进行比较。结果EMs组子宫在位内膜功能层的PGP 9.5表达为10.48±4.44，对照组未见PGP 9.5表达(P<0.01)。Spearman相关性分析：EMs患者子宫在位内膜功能层PGP 9.5表达与CPP的VAS评分呈正相关(r=0.833，P<0.01)，与rAFS无相关性(r=-0.094，P>0.05)。EMs患者术后使用GnRHa治疗后PGP 9.5表达及VAS评分显著低于治疗前(P<0.01)。结论EMs CPP患者在位内膜功能层中PGP 9.5的特异性表达，可能为EMs早期诊断提供新的生物标识物；EMs子宫在位内膜功能层PGP 9.5的高表达与CPP呈正相关，与rAFS无相关。GnRHa类药物缓解EMs CPP的原因之一是减少了EMs在位内膜中神经纤维分布密度。

子宫内膜异位症； 慢性盆腔痛； 在位内膜； 蛋白基因产物9.5

慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)是指持续的非周期性，不明原因的持续6个月以上，对非阿片类药物治疗无效的盆腔疼痛。有报道，CPP患者在门诊就诊数中达2%～10%[1]1466，严重影响妇女的生活质量。CPP病因复杂，涉及多个系统，其中约50%的患者腹腔镜探查原因是由子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)引起[2]，但对于EMs是如何导致CPP的具体机制仍不甚明确。本研究旨在探讨蛋白基因产物PGP 9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)在EMs患者子宫在位内膜功能层的表达，及其与CPP程度的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2012年6月至2014年6月在江西省妇幼保健院行手术治疗的EMs患者40例(EMs组)，经腹腔镜及病理活检确诊，均为育龄期妇女。年龄19～47(37.08±7.29)岁，月经规律，周期为28～32 d。CPP及手术疼痛的程度按视觉模拟评分法(visual analogue scale，VAS)评定：轻度19例，中度16例，重度5例。EMs手术分期(rAFS)按美国生育学会1996年修订的标准：Ⅰ期10例，Ⅱ期9例，Ⅲ期15例，Ⅳ期6例。无其他内分泌、免疫和代谢性疾病，术前3个月内未接受过激素治疗。选择同期手术的育龄期妇女40例(对照组)，年龄23～49(36.80±8.08)岁。其中卵巢单纯性囊肿或卵巢囊性畸胎瘤25例，子宫肌瘤15例，经手术及病理检查均排除EMs。全部病例标本取材经医院伦理委员会批准及患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集、治疗方法及随访

2组患者术前行刮宫术或宫腔镜下子宫内膜活检获取子宫在位内膜，均为增生期子宫内膜。EMs组术后使用促性腺激素释放激素激动剂(Gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRHa)治疗30例，随访3～6个月，再次取患者子宫在位内膜组织标本25例；失访5例。

1.2.2 检测方法

所有样本用10%甲醛固定18～24 h，常规脱水石蜡包埋，切片厚度4 μm，每例石蜡切片3张，1张常规行HE染色，2张行免疫组织化学(SP)检测。试剂采用鼠抗人PGP 9.5单克隆抗体(稀释浓度：1:100)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

免疫组织化学方法：石蜡切片常规脱蜡浸水，蒸馏水浸泡5 min，PBS冲洗3次；枸橼酸缓冲液煮沸(沸水浴)修复15 min，PBS冲洗3次；3%过氧化氢水溶液，室温孕育20 min，PBS冲洗3次；滴加正常山羊血清工作液，37 ℃ 孵育15 min，去除多余正常山羊血清工作液；滴加一抗鼠抗人PGP 9.5单克隆抗体(1:100)4 ℃过夜；复温20 min，PBS冲洗3次；滴加二抗37 ℃ 孵育20 min，室温孵育20 min，PBS冲洗3次；滴加三抗(链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液)37 ℃ 孵育20 min，PBS冲洗3次；DAB显色；蒸馏水充分冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 镜下观察及结果判断

应用同一光学显微镜观察免疫组织化学切片棕黄色神经纤维的分布情况，用同一图像采集系统对其进行拍摄，先在低倍镜下选取神经纤维高密度区，再转换成200倍镜，计数拍摄的视野中神经纤维的数目。计数5个不同视野中神经纤维的数目，取平均值作为该石蜡切片的神经纤维密度(即为PGP 9.5的表达)，由2名资深病理科医生分别计数。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 2组子宫在位内膜功能层PGP 9.5的表达

EMs组子宫在位内膜功能层的PGP 9.5表达为10.48±4.44，对照组未见PGP 9.5表达(P<0.01)。

2.2 EMs患者子宫在位内膜功能层PGP 9.5的表达与CPP的VAS评分、rAFS的相关性

采用Spearman法进行相关性分析：EMs患者子宫在位内膜功能层PGP 9.5表达与CPP的VAS评分呈显著相关性(r=0.833，P<0.01)，且随着CPP程度的加重，子宫在位子宫内膜功能层中PGP 9.5的表达有显著增高趋势；PGP 9.5表达与rAFS无相关性(r=-0.094，P>0.05)。

2.3 EMs患者GnRHa治疗前后子宫在位内膜功能层PGP 9.5的表达及VAS评分

EMs组术后使用GnRHa治疗30例(失访5例)，药物治疗后PGP 9.5表达及VAS评分均显著低于治疗前(均P<0.01)。见表1。

治疗时间nPGP9.5VAS评分/分GnRHa治疗前2511.30±4.26*6.72±1.54*GnRHa治疗后256.11±2.772.64±0.86

*P<0.01与GnRHa治疗后比较。

3 讨论

3.1 子宫内膜功能层PGP 9.5的表达

CPP是子宫内膜异位症主要的临床症状，表现为：痛经、深部性交痛、排便痛及器官功能异常等[3]，多位于下腹部及腰骶部，可放射至阴道、会阴、肛门及大腿。有研究[4]发现，CPP的发生与神经纤维异常增生及神经冲动传导异常相关，对于神经纤维异常增生及神经冲动传导异常的原因尚需进一步的研究。PGP 9.5是常用的神经纤维标识物，属泛素肽羧基末端水解酶类家族，在细胞水解途径中调节细胞进程，包括细胞的分裂周期和死亡。PGP 9.5在神经源性肿瘤中被首次发现，它是普遍存在的竣基末端轻化酶家族成员之一，可特异性地标记神经元细胞及神经纤维，主要标识有髓和无髓神经纤维(c纤维)[5]，是神经内分泌系统一特定的生物标记。因PGP 9.5可标记子宫所有的神经分布[6]，因此本研究以PGP 9.5作为子宫内膜及EMs子宫在位内膜神经分布的检测指标。研究结果显示：所有EMs患者子宫在位内膜功能层均有PGP 9.5的表达，而对照组(非EMs)的子宫内膜功能层无PGP 9.5表达(P<0.05)。所以，EMs患者子宫在位内膜功能层分布的神经纤维大多数为感觉神经C，即为新生的无髓感觉纤维，这与Tokushige等[7]的研究结果基本一致,可初步解释EMs疼痛多为钝痛的原因。

综上所述，在患有EMs妇女的子宫在位内膜的功能层发现神经纤维的分布，而非EMs妇女子宫内膜功能层未发现任何神经纤维分布。因此，只有EMs患者的子宫在位内膜功能层才能发现神经纤维的存在或密度更高的这一结论不但可以有助于进一步阐述EMs相关CPP产生的机制，而且可通过子宫内膜活检或诊刮术来检测子宫内膜功能层神经纤维密度(检测PGP 9.5的表达)可成为临床诊断EMs的一种新型生物分子指标，即新的EMs的生物标识。传统上，腹腔镜检查及术中组织活检被认为是EMs诊断的“金标准”，可较全面地观察病变[8]。但是手术的风险仍然超过潜在的未被证明的益处，而且有研究[4]表明，EMs出现到明确诊断所需的时间为6～7年之久，这大大延误了早期EMs的诊断和治疗。本研究提示，PGP 9.5可能成为早期诊断EMs的生物标记物，可根据在子宫内膜功能层中能否检测出PGP 9.5表达，结合临床表现及其他生物指标，预测其患EMs的概率，有利于EMs的早期诊断、及时治疗。也有研究[9-10]提示，PGP 9.5在子宫腺肌症中也有特异性表达，为其诊断提供了新的方向及后续治疗提供更大空间。

3.2 EMs患者子宫在位内膜PGP 9.5表达与CPP的VAS评分及rAFS的相关性

本研究发现，PGP 9.5在EMs患者子宫在位内膜功能层的表达与CPP的VAS评分成正相关(r=0.833，P<0.01)，即PGP 9.5表达越高，疼痛程度越重。而PGP 9.5的表达与rAFS无显著相关性(r=-0.094,P>0.05)。rAFS是目前EMs临床诊治中常用的分期方法，但是腹腔镜手术中主要依据卵巢和腹膜的病灶大小、粘连程度进行分期，未考虑疼痛的程度以及深部侵润病灶的分布，具有主观随意性。临床研究[11-12]发现，rAFSⅢ—Ⅳ期EMs患者盆腔病变可能仅表现为体积较大的卵巢囊肿，没有明显的疼痛症状，而部分有严重疼痛症状的阴道直肠隔患者EMs分期较早，多伴有明显的疼痛症状。因此EMs的rAFS没有考虑盆腔外的内膜异位病灶，与疼痛以及深部侵润病灶的分布无关，对预测盆腔痛及治疗方案参考价值不大[1]1492-1493。所以，本研究进一步证实EMs相关的CPP程度与rAFS无明显相关性。

3.3 GnRHa药物治疗与CPP的关系

GnRHa其作用机制是与下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)受体结合并占据受体结合位点,继而减少垂体的黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)分泌，使卵巢实现“药物性切除”，雌、孕激素水平下降至去势水平。有研究[13-15]发现，GnRHa不仅通过降低雌激素直接抑制异位内膜的生长，还可通过调节细胞因子、受体水平、芳香化酶等作用达到治疗效果，并能显著改善CPP症状，缩小病灶、降低术后复发，并提高治疗后的妊娠率，现已成为一线治疗方案。本研究结果显示：EMs患者应用GnRHa药物后，子宫在位内膜功能层PGP 9.5的表达较术前明显降低，提示应用GnRHa药物缓解EMs相关疼痛的原因之一是减少了EMs在位子宫内膜中神经纤维分布密度，即降低PGP 9.5的表达。

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(责任编辑：周丽萍)

Clinical Significance of Expression of PGP 9.5 in Eutopic Endometrium of Patients with Endometriosis-Related Chronic Pelvic Pain

LUO Yan,LUO Ming-yan

(DepartmentofReproductiveEndocrinology，JiangxiProvincialMaternalandChildHealthHospital，Nanchang330006,China)

Objective To study the expression of protein gene product 9.5(PGP 9.5) in the functional layer of eutopic endometrium and its relation to chronic pelvic pain(CPP) in patients with endometriosis(EMs),and to investigate the role of PGP 9.5 expression and the curative efficacy of gonadotrophin-releasing hormone agonist(GnRHa) in EMs-related CPP.Methods The expression of PGP 9.5 in the functional layer of eutopic endometrium was detected by immunohistochemistry in 40 patients treated with surgery for EMs(EMs group) and 40 women of childbearing age(control group).The degree of CPP and stage of endometriosis were evaluated by using visual analogue scale(VAS) and revised American Fertility Society(rAFS) classification system,respectively.The correlations of VAS and rAFS scores with PGP 9.5 expression were analyzed by using Spearman method.In addition,the expression of PGP 9.5 was detected in EMs patients before and after treatment with GnRHa.Results The expression of PGP 9.5 in the functional layer of eutopic endometrium was 10.48±4.44 in EMs group.No PGP 9.5 expression was found in control group.In patients with EMs-related CPP,PGP 9.5 expression was positively correlated with VAS score(r=0.833，P<0.01),but was not correlated with rAFS score(r=-0.094，P>0.05).After operation,the treatment with GnRHa significantly reduced PGP 9.5 expression and VAS score in patients with EMs(P<0.01).Conclusion The PGP 9.5 is expressed specifically in the functional layer of eutopic endometrium,suggesting that PGP 9.5 may be a new biomarker for early diagnosis of EMs.The high expression of PGP 9.5 in eutopic endometrium is positively correlated with CPP,but is not correlated with rAFS in EMs patients.The GnRHa can relieve the EMs-related CPP through reducing the density of endometrial nerve fibers.

endometriosis; chronic pelvic pain; eutopic endometrium; protein gene product 9.5

2015-06-18

江西省卫生厅科技计划项目(20133123)

罗燕(1981—)，女，硕士，副主任医师，主要从事生殖内分泌的基础与临床研究。

R 711.71

A

1009-8194(2015)12-0043-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2015.12.018