盐胁迫对黄花蒿生长及其挥发性成分的影响

郁 霄，潘魏松，田 浩，2，王剑文*

1苏州大学医学部药学院，苏州 215123;2 云南省农业科学院药用植物研究所，昆明 620205

黄花蒿(Artemisia annua L.)是抗疟药物——青蒿素的资源植物。除青蒿素外，黄花蒿还含有重要的挥发性成分，其中以单萜和倍半萜为主，主要包括樟脑、l，8-桉树脑、石竹烯、莰烯、蒎烯和大根香叶烯等化合物［1］。这些成分具有显著的抗植物病原菌［2］、驱虫、止咳平喘、消炎抗菌等药理活性［3］。黄花蒿挥发性物质的诱导已见报道，如UV-B 辐照处理黄花蒿幼苗3 h，诱导黄花蒿挥发油产量提高1.2倍［4］。施加1.2 mmol/L 纳米银处理黄花蒿，可诱导单萜物质的合成，且在100 μmol/L 茉莉酸甲酯共同作用下，青蒿酮相对含量提高了2.05 倍［5］。关于黄花蒿不同生长阶段(生长期、开花前期、开花期及开花后期)地上部分的挥发油产量及组成变化已有报道［6］。

黄花蒿生态适应性极广，是荒地先锋植物，在盐碱地也多见生长［3］。盐胁迫可以改变药用植物挥发油成分组分和产量，50 mmol/L NaCl 可诱导鼠尾草(Salvia officinali L.)果实挥发油产量提高1.59倍，同时挥发油的成分组成发生变化［7］。唇萼薄荷(Mentha pulegium)用50 mmol/L NaCl 处理5 周后，挥发油产量提高2.75 倍，其主要组分胡薄荷酮的相对含量则从23.91%增加至37.98%［8］。但盐胁迫对黄花蒿的生长、生理及挥发性次生代谢物合成的影响尚少见报道，本实验通过对盆栽黄花蒿幼苗浇灌NaCl 溶液处理，考察盐胁迫对黄花蒿植株生长、生理活性及青蒿素、挥发性成分合成的影响，探讨黄花蒿对盐胁迫的生理响应，研究盐胁迫对黄花蒿次生代谢生物合成的影响，为黄花蒿盐碱地栽培条件的优化、探讨黄花蒿活性成分的调控方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、仪器和试剂

实验材料为黄花蒿(Artemisia annua L.)幼苗，黄花蒿种子(cv.CQF39)由云南省昆明市云南省农业科学院提供。

电子天平、紫外分光光度计、离心机、超声波清洗器、LI-COR 公司LI-6400 便携式光合仪、Agilent-1260 型高效液相色谱系统、Agilent 5975C-6890 气相色谱-质谱联用仪。

NaCl(分析纯)、蒸馏水、甲醇(色谱纯)、正己烷(分析纯)。

1.2 幼苗培养

用20%的次氯酸钠对黄花蒿种子进行表面灭菌，之后用无菌的蒸馏水冲洗种子三遍。将种子撒于装土(泥炭和珍珠岩1∶1，v/v)的托盘萌发，并置于温度(25±2)℃，湿度70%，每天光照时间16 h的温室中培养。待培养一个月后，将长势相同的黄花蒿幼苗转入小盆中培养，每盆一株。待盆中的黄花蒿幼苗长出4 片真叶后，开始对幼苗进行盐胁迫处理。

1.3 试验设计

本试验采用单因素完全随机区组试验设计，每个分组处理的盐浓度分别为2、4、6、8 g/L，每两天浇一次盐溶液，对照组浇灌等体积的蒸馏水。每个处理设置3 个重复，开始处理后1 个月采集样品测定各指标。

1.4 株高和干重的测定

测量每组黄花蒿植株地上部分的高度。收集每个处理组的黄花蒿植株，置于50 ℃烘箱，干燥至恒重后用电子天平称重。

1.5 过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的测定

H2O2含量通过KI 法测定［9］。脂质过氧化物MDA 的含量用硫代巴比妥酸(TBA)法进行测定［10］。

1.6 抗氧化酶活性的测定

采用氮蓝四唑(NBT)光化学还原法测定SOD活力;过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外吸收法;愈创木酚法测定POD 活性［11，12］。

1.7 净光合速率和蒸腾速率的测定

使用LI-6400(美国，LI-COR 公司)便携式光合测定系统测定生长完好、叶面积相近且完全展开的黄花蒿叶片净光合速率和呼吸速率。测定过程中，分析仪每30 分钟校准调零一次。每片叶子置于封闭的气体交换室测定1 min。测定条件为:晴朗天气，上午9∶30～10∶00，温度25～27 ℃。

1.8 青蒿素含量测定

青蒿素的测定参照文献［13］，称取黄花蒿粉末0.1 g，加入30 mL 30～60 ℃沸程的石油醚，超声提取1 h。之后于40 ℃水浴挥干溶剂，加入色谱甲醇充分溶解，加入NaOH 溶液衍生后，经0.45 μm 滤膜过滤用于高效液相进样检测。色谱条件:Agilent HC-C18(4.6 ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇-磷酸盐缓冲液(50∶50);流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:260 nm。

1.9 挥发油的提取和测定

称取黄花蒿粉末2 g，加入10 mL 正己烷，轻轻摇匀使黄花蒿粉末浸没，在超声槽内超声2 h，之后将黄花蒿粉末浸液放置5 ℃保存过夜。提取液用0.45 μm 尼龙膜过滤后立即进行测定。气相色谱条件:载气为高纯度氦气，体积流量为1 mL/min，分流比20∶1 进样量为1 μL;进样口温度为280 ℃，接口温度为240 ℃;程序升温:60 ℃(0 min)，3 ℃/min到240 ℃，保持5 min。质谱条件:电子轰击(EI)离子源，电离电压70 eV;离子源温度230 ℃;扫描范围35～780 amu。各分离组分采用美国国家标准局NIST2008 谱库检索定性，采用色谱峰面积归一法进行相对定量。

1.10 数据分析

实验每个处理重复三次，所得结果以平均值±SD 表示，利用Excel 软件采用t 检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对黄花蒿植株生长的影响

随着盐浓度(2～8 g/L)的增加，黄花蒿幼苗生长被抑制，处理一个月后，对照组植株的高度为10.6 cm，而盐浓度最高(8 g/L)的处理组植株的高度仅为5.1 cm(图1)，植株干重减少到对照的36%左右。在试验中我们发现随着处理的盐浓度的增加，植株叶片皱缩枯萎的情况加剧，6～8 g/L NaCl处理下的黄花蒿幼苗出现了比较高的死亡率。

图1 盐胁迫对黄花蒿株高和植株干重的影响Fig.1 Effect of salt stress on height and dry weight of A.annua seedlings

2.2 盐胁迫对黄花蒿的氧化损伤及抗氧化酶活性的影响

4 g/L NaCl 溶液胁迫处理黄花蒿植株一个月后，处理组植株中H2O2的含量比对照增加了72.7%，且MDA 量高于对照组25.25%(图2)。黄花蒿植株持续性的氧化损伤也引起了植株叶片中抗氧化酶活性的提高。在4 g/L NaCl 处理1 个月后，植株叶片中抗氧化物酶SOD、CAT 和POD 的活性分别比对照提高了43.9%、70.9%和42.4%(图3)。

图2 盐胁迫对黄花蒿植株H2O2和MDA 含量的影响Fig.2 Effect of salt stress on H2O2and MDA contents of A.annua seedlings

图3 盐胁迫对黄花蒿植株抗氧化酶SOD、CAT 和POD 活性的影响Fig.3 Effect of salt stress on SOD，CAT and POD activity in A.annua seedlings

2.3 盐胁迫对黄花蒿净光合速率和蒸腾速率的影响

盐胁迫处理的黄花蒿植株表现出光合活力的抑制。4 g/L NaCl 溶液处理的植株叶片净光合速率降低27.9%，表现出叶片生长上一定程度的损伤。同时，盐胁迫处理组叶片的蒸腾速率也比对照组降低39.5%(图4)。

图4 盐胁迫对黄花蒿植株净光合速率和蒸腾速率的影响Fig.4 Effect of salt stress on net photosynthetic and transpiration rate of A.annua seedlings

2.4 盐胁迫对黄花蒿次生代谢的影响

图5 盐胁迫对黄花蒿植株青蒿素含量的影响Fig.5 Effect of salt stress on artemisinin content of A.annua seedlings

在对试验中黄花蒿叶片中青蒿素含量进行测定后，我们发现施加4 g/L NaCl 溶液处理一个月后，处理组的青蒿素含量相比对照增加了44.3%(图5)。青蒿素作为黄花蒿植株重要的次级代谢产物，在盐胁迫刺激下其含量表现出明显的增多。

我们采用GC-MS 对黄花蒿植株挥发性组分进行鉴定，得到总离子流图，并通过面积归一化法定量挥发油组分的相对含量，结果见表1。GC-MS 共分离出58 个峰，鉴定出挥发油中40 个主要化学成分。对照组和处理组已鉴定出的组分占挥发油总量的77.74%和78.73%。GC-MS 的分析结果表明，黄花蒿植株的代谢产物较多，包括有醇、醛、酮、烯、内酯、烷烃、羧酸、多环化合物、杂环化合物等。主要成分包括:叶醇18.14%、大根香叶烯9.35%、邻苯二甲酸二异丁酯6.60%、新丁香萜烯5.93%、α-萜品醇4.75%、二十二烷醇3.61%、乙酸3.19%、青蒿素2.97%、脱氧青蒿素2.78%和没食子酸2.58%。盐胁迫处理后黄花蒿植株挥发油成分的组成没有发生变化。但是挥发油各组成成分的相对含量出现了比较明显的变化。例如叶醇相对含量减小至15.85%，大根香叶烯相对含量减小至9.04%。同样的盐胁迫处理也伴随着一些主要成分相对含量的增加，例如:邻苯二甲酸二异丁酯增加了1.3 倍、白菖油萜增加了1.3 倍、脱氧青蒿素增加了1.2 倍、α-萜品醇增加了1.1 倍。另外，GC-MS 测定的盐胁迫处理后青蒿素的相对含量相比对照增加了39.73%，这与之前通过高效液相色谱测定出的青蒿素含量变化的结果一致。

表1 黄花蒿挥发油成分鉴定Table 1 Analysis of chemical constituents in volatile oil of A.annua

3 讨论

本研究中，盐胁迫对黄花蒿植株的影响主要表现为对其生长的抑制，叶片光合速率下降。黄花蒿植株叶片蒸腾速率降低，减少了植物细胞水分的散失，维持渗透压的水平，帮助抵御逆境。在盐胁迫下，植株细胞中活性氧的产生与清除平衡被打破［14］，4 g/L NaCl 处理黄花蒿植株一个月后，胞内H2O2含量显著升高。盐胁迫引起的这种活性氧的产生与积累将导致细胞膜脂过氧化、膜的选择通透性丧失。在盐胁迫作用下，黄花蒿植株抗氧化酶SOD、CAT 和POD 活性均呈现出不同程度地升高，以减轻黄花蒿植株在盐胁迫下遭受的氧化损伤。

植物的次生代谢是植物体内的另一种重要的生理代谢，次级代谢产物的合成与积累与植物的生长环境密切相关。在本研究中，4 g/L NaCl 溶液处理黄花蒿植株一个月，植株中青蒿素含量显著增多，说明青蒿素的生物合成对盐胁迫有应答反应。而且，黄花蒿植株挥发组分相对含量也发生显著变化，邻苯二甲酸二异丁酯、白菖油萜、脱氧青蒿素、α-萜品醇的相对含量在盐胁迫处理后显著增加，而叶醇及大根香叶烯在盐胁迫处理后相对含量明显降低。这些受盐胁迫诱导的物质如邻苯二甲酸二异丁酯、α-萜品醇具有显著的抗虫和抑菌活性［15，16］。我们的研究表明:盐胁迫也可作为黄花蒿活性挥发性成分一种诱导方式，本研究结果对于黄花蒿盐渍地栽培具有参考应用价值。

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