黄柏不同粒径粉体显微特性及溶出性能研究

褚洪标，汪小英，张燕军，曾 红，周秋贵

井冈山大学医学院，吉安 343009

黄柏为芸香科植物黄树皮(Phellodendron chinense Schneid.)及黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥树皮，为传统中药材，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的功效［1，2］。现代药理研究表明，其主要成分有生物碱类以及多种黄酮类、黄柏内酯等化合物，具有抗细菌、真菌、病毒及其他病原微生物等多种作用［3］。超微粉碎技术应用于中药领域具有提高药物生物利用度、降低服用量、改善制剂品质、有利于难溶性成分的溶出等方面的优势［4-7］。黄柏属于皮类药用植物，细胞壁结合紧密，不利于有效成分的溶出，因此对黄柏进行微粉化是必要的。

本实验采用近年来新兴的中药材超微粉碎技术粉碎黄柏，通过对不同粒度黄柏粉体显微特性和主要成分盐酸小檗碱的提取率及累积溶出率进行比较，考察超微粉体与普通粉体的差异，为中药黄柏的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

黄柏样品于2014年5 月购于江西省吉安市，由井冈山大学医学院生药学教研室梁兆昌教授鉴定为芸香科植物黄皮树(Phellodendron chinense Schneid.)的干燥树皮。盐酸小檗碱对照品(北京盛世康普化工技术研究院，批号633-65-8，质量分数以98%计);胃蛋白酶［酶活力(U/g)≧1200.0］，胰蛋白酶［酶活力(U/g)≧50000］;乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2 仪器

ZN-400A 高速中药粉碎机(浙江省瑞安市飞达药材器械厂)、HM-701 超微粉碎机(北京环亚天元机械技术有限公司)、S-3500N 扫描电镜(日本日立公司)、Mastersizer 2000 激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)、Nicolet5700 傅立叶红外光谱仪(美国尼高力公司)、RC-6D 溶出度测试仪(天津市光学仪器厂)、LC-10AT 型高效液相色谱仪(日本岛津)、DV215CD 型电子天平(美国奥豪斯)、SL-250 型超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 黄柏粉体的制备、粒度测定及细胞破壁率计算

制备超微粉体时，设置超微粉碎机相关参数(主机频率、风机频率)和粉碎机部件状态(进样调节器、研轮调节器等、出料阀门)进行粉碎。在粉碎过程中粉体的粒径主要受风速的影响，而风速主要由风机频率控制，故在实验中主要通过调节风机频率来制备不同粒径的粉体。实验中为探究不同粒径粉体特性而设置了高、中、低三个不同风机频率60、40、20 Hz。

黄柏药材经充分干燥后，利用粉碎机粉碎得黄柏普通粉体;再利用超微粉碎机将经预粉碎后的黄柏药材(普通粉体)进行粉碎，分别得到不同粒径的黄柏超微粉体，四个不同粒径的黄柏粉体分别记为黄柏普通粉体、60 Hz 超微粉体、40 Hz 超微粉体、20 Hz 超微粉体。

利用激光粒度仪测定以上四种粉体的粒径，并绘制出以体积为基准的粒径频率分布图和累积分布图，得到各粉体的中位径D50值。理想破壁模型单元的细胞破壁率的计算公式为:n＞1 时，破壁率η=1-(1-1/n)3，n≤1 时，破壁率η=100%(n 为粉末粒径与细胞直径的比值)。李雅［8］等对多种中药材的各种细胞尺度进行分析，最后认为细胞最小尺寸可按10 μm 进行确定，本实验亦以此标准作为理想破碎模型的细胞直径。

2.2 粉体的表面形貌观察

分别取黄柏普通粉体、60 Hz 超微粉体、40 Hz超微粉体、20 Hz 超微粉体适量，铺于扫描电子显微镜(SEM)样品台上，喷金镀膜后置SEM 下放大500倍观察黄柏粉体的结构及表面形态。

2.3 黄柏粉体堆密度及休止角的测定

分别取适量不同粒径大小的黄柏粉体，运用漏斗法来测量，用50 mL 刻度的量筒，木棍轻敲使其堆积结实测定其体积V，运用堆密度公式ρ=m/V，求得堆密度ρ，重复三次，求得堆密度平均值。

休止角的大小反映粉体颗粒之间相对运动自由程度，运用漏斗法测量，休止角公式:θ=arctg(2H/R):R-圆锥体半径，H-圆锥体高度。影响休止角大小的因素是复杂的，包括物料混合程度、颗粒大小、表面性质、荷电、湿度、堆积体的颗粒位置分布等［9］。

2.4 黄柏粉体红外光谱比较

傅立叶红外光谱技术具有样品用量少、分辨率高、扫描速度快等特性，利用该技术进行同种类不同粉碎粒径的药材分析鉴别，取得了很好的效果。本实验利用傅立叶红外光谱溴化钾压片法，对黄柏普通粉体与超微粉体进行测试，比较其红外谱图特征。

2.5 黄柏粉体相对提取率比较

分别取黄柏不同粒径粉体各约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，准确加入甲醇25 mL，称得总重，将锥形瓶放在超声波清洗器(频率为40 KHz，功率为120 W)中超声提取20 min，冷却后，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀滤过，取续滤液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，收集滤液。按上述方法改变超声时间，分别超声提取40 min、60 min 即得供试品，利用HPLC 方法对供试品进行盐酸小檗碱的含量测定，比较黄柏不同粒径粉体提取率的高低。

2.6 黄柏不同粉体溶出度实验

分别取2.1 项下制备的黄柏普通粉体、60 Hz超微粉体、40 Hz 超微粉体、20 Hz 超微粉体各约3 g，精密称定，投入溶出仪中，按照中国药典2010年版二部附录溶出度浆法测定法［10］，以已超声脱气的900 mL 蒸馏水为溶剂，浆法，转速为100 rpm，温度为(37±0.5)℃，分别于5、15、30、45、60 min 各取样5 mL，同时向溶出杯中补充相同温度和体积的水，将取出来的样品滤过，取续滤液过0.45 μm 滤膜，得到以蒸馏水为溶出介质的供试品，待测含量。按上述方法，根据中国药典2010年版一部附录［11］项下制备人工胃液、人工肠液，溶出实验步骤同蒸馏水，分别得到以人工胃液、人工肠液为溶出介质的供试品，利用HPLC 方法对供试品进行含量测定，比较黄柏不同粒径粉体相对累积溶出率的高低。

2.7 样品含量测定

2.7.1 色谱条件

Shimpack ODS 色谱柱(4.6 ×150 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50，含0.1%的十二烷基硫酸钠);检测波长为265 nm;流速为1 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL。

2.7.2 对照品溶液制备

精密称取盐酸小檗碱对照品0.300 mg 置10 mL 容量瓶中，加流动相溶液定容为每1 mL 含0.030 mg 的盐酸小檗碱对照品储备液。

2.7.3 线性关系考察

分别精密吸取2.7.2 项下制备的盐酸小檗碱对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL，在2.7.1 项下条件进样，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程:Y=2 ×106x+230399，r=0.9996，表明线性关系良好。

2.7.4 精密度试验

取盐酸小檗碱对照品储备液，在2.7.1 项条件下连续进样5 次，测定峰面积，其RSD 为0.95%(n=5)，说明仪器精密度较好。

2.7.5 稳定性试验

取同一供试品(40 Hz 超微粉体提取40 min)溶液，分别于0、2、4、8、10、12 h 在2.7.1 项条件下进样测定峰面积，其RSD 为1.19%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7.6 重复性试验

取5 份同批次的黄柏40 Hz 超微粉体0.5 g，按2.5 项下方法制备供试品溶液，超声40 min，在2.7.1条件下测得峰面积，其RSD 为1.09 %。

2.7.7 加样回收率试验

取已测定含量的黄柏40 Hz 超微粉体样品5份，加入盐酸小檗碱对照品适量，按照2.5 项下的方法操作，超声40 min，制得供试品溶液，在2.7.1 条件下测得峰面积，计算回收率，结果显示盐酸小檗碱平均回收率为101.87%，其RSD 为1.39%。

3 实验结果

3.1 黄柏细胞破壁率

黄柏普通粉体、60 Hz 超微粉体、40 Hz 超微粉体、20 Hz 超微粉体的中位径D50值分别为210.333、57.517、34.276、44.424 μm。黄柏经超微粉碎后，中位径D50最小可达到34.276 μm，说明超微粉碎可使黄柏药材粒径大大减小。根据细胞破壁率计算公式得出黄柏普通粉体、60 Hz 超微粉体、40 Hz 超微粉体、20 Hz 超微粉体的破壁率分别为13.60 %、43.60 %、64.50 %、53.50 %。以上结果表明，随着超微粉体粒径的减小，粉体的破壁率增大，但粒径减小到一定程度，破壁率反而下降。

3.2 粉体的表面形貌观察

通过观察黄柏普通粉体、60 Hz 超微粉体、40 Hz超微粉体、20 Hz 超微粉体，从整体上可以看出黄柏颗粒大小在逐渐减小(如图1 所示)，普通粉体颗粒大小形状不规则，表面粗糙，可以看到原药材的粉末特征，比较黄柏超微粉体和普通粉体，黄柏超微粉体大小逐渐有均匀的趋势，颗粒表面越来越光滑，原药材特征越来越不明显。

图1 黄柏普通粉体(A)、60 Hz 超微粉体(B)、40 Hz 超微粉体(C)、20 Hz 超微粉体(D)的电镜扫描结构(×500)Fig.1 SEM photographs (×500)of common (A)，60 Hz (B)，40 Hz (C)，20 Hz (D)powders of P.chinensis

3.3 堆密度及休止角的测定

黄柏普通粉体、60 Hz 超微粉体、40 Hz 超微粉体、20 Hz 超微粉体的堆密度及休止角数据见表1。由表1 可知，黄柏粉体的堆密度在一定粒径范围内随着粒径的减小而减小，原因是在一定质量下，粒径越小，粉末表面积逐渐变大，颗粒间的摩擦力逐渐增大，妨碍粉末颗粒的堆积，堆积体积增大，堆密度减小;当小于这个临界点时，粒径颗粒太细，在用木棒轻敲时，颗粒会较好的对堆积空隙填充，堆积体积减小，堆密度反而增大。表1 数据显示，休止角随着粉体粒径减小而增大，原因是测定同一种粉体或颗粒时，粒径越小，它的相互粘附力越大，粉体的流动性减弱，从而导致休止角增大。

表1 黄柏粉体堆密度及休止角的测定(n=3)Table 1 Measurement of bulk density and angle of repose of powders from P.chinensis (n=3)

3.4 黄柏粉体红外光谱

本实验利用傅立叶红外光谱测定黄柏普通粉体与超微粉体的官能团吸收特征，比较其红外谱图特征，四个样品在3420、2926、1740、1430、1200 cm-1处分别有羟基、甲氧基、内酯羧基、不对称二甲基以及C-C 键，C-O 键的不对称振动吸收，四个样品吸收峰峰值偏差在±20 cm-1内，主要官能团不发生变化，表明黄柏超微粉碎不破坏其化学成分，能够保持黄柏的生物活性。

3.5 相对提取率

根据2.5 项下的方法制备供试品，在2.7.1 项条件下进样测定。对照品盐酸小檗碱和供试品HPLC 图谱见图2。

图2 盐酸小檗碱对照品(A)和供试品溶液(B)HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride standard (A)and sample (B)

利用峰面积，由2.7.3 项下线性方程计算得到盐酸小檗碱的质量分数，进一步计算出相对提取率，见图3。分析图3 可知，在一定时间范围内，超声时间越长提取率增加不明显，甚至会降低(如60 Hz 超微粉体)。在同一提取时间内比较不同粒径的提取率可知，超微粉体的提取率大于普通粉体(20 Hz 超微粉体除外)，说明超微粉碎有利于黄柏成分的溶出;在同一时间内比较超微粉体间的提取率可知，粒径越小不一定提取率就越高(如20 Hz 超微粉体)。

图3 黄柏不同粒径粉体超声提取的相对提取率Fig.3 Relative extraction yield of ultrasonic extraction of different powders of P.chinensis

3.6 相对累积溶出率

在2.7.1 色谱条件下，进行供试品含量测定。根据标准曲线方程计算各供试品中盐酸小檗碱的累积溶出量，分别以所测得的盐酸小檗碱最大峰面积值对应的累积溶出量作为100%，其他累积溶出量与之相对比，得出各供试品盐酸小檗碱的相对累积溶出率，以相对累积溶出率为纵坐标，时间为横坐标作图，绘制累积溶出度变化曲线，见图4。

分析图4 可知，以水为溶出介质时，60 Hz 超微粉体、40 Hz 超微粉体的相对累积溶出率较大，而20 Hz 超微粉体的相对累积溶出率比普通粉体还要小。以人工胃液为溶出介质时，40 Hz 超微粉体的相对累积溶出率较大，60 Hz 超微粉体与普通粉体相对累积溶出率差异不大，20 Hz 超微粉体的相对累积溶出率数值最小。以人工肠液为溶出介质时，60 Hz超微粉体、40 Hz 超微粉体的相对累积溶出率较大，20 Hz 超微粉体的相对累积溶出率数值最小。超微粉体间比较，并不是粒径越小溶出率越大，本实验中60 Hz 和40 Hz 超微粉体的粒径溶出率最大，进一步说明了适度的超微粉碎是必要的。

图4 黄柏粉体在蒸馏水(A)、人工胃液(B)、人工肠液(C)溶出介质的相对累积溶出率示意图Fig.4 Relative cumulative dissolution rates of distilled water (A)，simulated gastric fluid (B)and simulated intestinal fluid (C)of different powders of P.chinensis

4 讨论

4.1 色谱条件的选择

关于黄柏中盐酸小檗碱含量测定的色谱条件不一，本实验在借鉴《中华人民共和国药典》(2010)中的色谱条件:以乙腈-0.1%磷酸溶液(50 ∶50)(每100 mL 加十二烷基磺酸钠0.1 g)为流动相的基础上，将十二烷基磺酸钠换为十二烷基硫酸钠，实验结果表明在此条件下峰形对称性较高，无拖尾现象，且其与其他成分分离度、重现性好，故本次实验采用乙腈-0.1 %磷酸溶液(50∶50)(每100 mL 加十二烷基硫酸钠0.1 g)为流动相［12］。

4.2 测定成分的选择

黄柏的主要成分为盐酸小檗碱，作为抗菌药在临床上已应用多年，其疗效确切，是一种广谱抗菌药物。现代研究证明小檗碱有抗肿瘤、抗心律失常、降压、降血糖等作用，在临床上有越来越广泛的应用，需求量日益增加。《中华人民共和国药典》(2010)规定黄柏按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱计，不得少于3.0%。因此本次实验通过测定盐酸小檗碱的提取率和溶出度来比较不同粉体之间的含量差异。

4.3 提取率提取方法的选择

中药常用的提取方法有超声提取和回流提取等方法。有关文献［13］表明，通过这两种方法，分别超声提取20、40、60 min，回流提取1、2 h，以提取率为指标，超声40 min 的效果最好，回流2 h 的效果虽优于超声40 min，然而回流提取操作繁琐，误差较大，因此采用超声提取的方法来比较不同粉体间提取率的高低。也可采用传统浸泡法提取，但是提取工艺繁琐，费时费力，且提取率不高。

有关文献［14］中通过正交实验设计考察超声提取的频率、次数、时间等因素对盐酸小檗碱提取率的影响，结果表明60 KHz 超声提取3 次，每次20 min的提取率最高。因此本次实验设置了3 个时间点，分别为20、40、60 min，通过不同的时间来比较不同粒径粉体之间的提取率。

4.4 不同溶出介质的选择

由于药物在人体内的吸收有着极其复杂的情况，为了探究黄柏在人体内外的溶出情况，本次实验按照2010 版《中华人民共和国药典》第二部溶出度测定法桨法模拟蒸馏水、人工胃液和人工肠液，通过设置5 个不同的取样点，测定其有效成分的溶出情况，进而比较其在人体内的溶出情况。综合本次实验结果，从溶出量来看，不论是在水、胃液还是肠液中溶出，60、40 Hz 超微粉体的溶出量较大;从溶出介质来看，在人工肠液中的溶出率略大于在水、人工胃液的溶出率，说明该成分在碱性环境中更有利于溶出。

5 结论

通过对实验结果的分析可知，在一定范围内，随着粉体粒径的减小，堆密度减小，休止角增大。超微粉碎后粉体(粒径从大到小)平均粒径大小逐渐有均匀的趋势，颗粒表面越来越光滑，原药材特征越来越不明显，且微粉化技术的应用并未改变原药材的主要官能团结构。本次实验结果表明，适度的超微粉碎有利于黄柏成分的溶出，但如果粒径太小，反而影响超微粉体的溶出效果，原因可能有以下两个方面:一是超微粉碎技术可提高细胞破壁率，使有效成分溶出阻力减小，且超微粉体具有较大的分散性和较强的吸附性，从而提高了有效成分的溶出速率。二是超微粉体具有较大的比表面积和表面能，使各粉体之间处于非稳定状态，最终因强烈的吸引作用而达到稳定状态，这种吸引作用导致颗粒之间相互团聚从而影响溶出效果。

伴随着超微粉碎药物粒度的减小，其溶解度和溶解速度不会无限增大，并且由于粒径的减小容易导致表面能增加，使颗粒处于不稳定状态，易聚集形成假大颗粒，易吸潮，易吸附空气中的杂质，影响吸收，增加存放难度［15，16］。对于药用植物皮类药材，由于不同药材有不同的组织结构，每一种药材其超微粉体的适宜粒径不尽相同，因此对不同药材的超微粉碎都要适度。

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