响应曲面法优化高纯度油橄榄叶橄榄苦苷酶解工艺

原姣姣 ，王成章，2* ，叶建中，陈虹霞，张宇思，陶 冉，周 昊，2，刘玉红

1中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;生物质化学利用国家工程实验室;国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室;江苏省生物质能源与材料重点实验室，南京 210042;2 中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091;3 陇南市翔宇油橄榄开发有限公司，陇南 746000

羟基酪醇(3，4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，HT)，清除自由基的能力强，表现出独特的生物活性［1-5］，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流等。还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL60［6］、腺癌细胞HT29 及HT29 克隆体19A［7］、女性乳腺癌MCF-7 细胞［8］等扩散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。尽管羟基酪醇有诸多生物活性，但国际市场上还没有批量生产天然羟基酪醇产品。天然羟基酪醇在橄榄叶中含量很低，仅有0.01%～0.8%［9］，大多数以酯化物(橄榄苦苷，Oleuropein，OE)的形式存在于油橄榄的各个部位。其中油橄榄果及叶中OE 含量高，尤其在叶中达到10%～17%［10］。目前HT 主要是从橄榄果、叶，以及在制备橄榄油或餐用橄榄果过程中产生的残渣和废水中分离的，而废水中橄榄苦苷、女贞苷、毛蕊花苷等糖苷、黄酮苷及多酚类物质成分复杂，分离效率低。现化学合成已有以酪醇［11］、3，4 -二羟基苯乙酸［12］、邻苯二酚［13］、3，4-二羟基苯甲醛［14］等合成报道，但收率低，且原料和催化剂成本昂贵，反应条件苛刻，无法工业化制备。采用生物转化法合成羟基酪醇，大都以橄榄苦苷和酪醇进行酶降解［15-17］或者菌种(细菌［18-20］和真菌［21，22］)的转化。此法反应条件温和，转化率高，环境污染小，具有不可比拟的优势，已成为国内外学者的研究热点。

Briante 等［16］利用固定化的嗜高温β-葡萄糖苷酶(pH=7.0，60 ℃)降解OE(橄榄叶提取物)，并从复杂的酶解物中分离出91%～94%以上的HT，但该方法成本昂贵。卜文文等［23］还对盐酸法和β-葡萄糖苷酶法水解橄榄叶提取物制备羟基酪醇的方法进行了结果比较，从生产成本角度认为盐酸法比酶法更适合，但酶法降解得到的羟基酪醇含量也很低，需要复杂的纯化工艺来获得高纯度产品。

本实验采用高纯度(81.04%)的橄榄苦苷橄榄叶提取物，筛选各种酶以确定最佳酶解效果和价格适宜的降解酶系，使其后续分离纯化工作以及探讨酶解机理相对简单。在单因素试验(时间、pH、温度、酶底物比)基础上，采用响应面法(response surface methodology，RSM)实验设计，以测得的HT 含量为考核指标，对pH、温度、酶底物比的水平参数选择进行优化，进而确定最佳酶解工艺，对油橄榄叶有效制备HT 具有重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

HT 对照品(纯度≥98%)和OE 对照品(纯度≥98%)，上海阿拉丁试剂公司。甲醇为市售色谱纯试剂，磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等其余试剂均为市售分析纯试剂。橄榄叶提取物(OE 含量为81.04%，HT 含量2%左右)，实验室自制，密封放于干燥器内备用。中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁酶、β-葡萄糖苷酶均购于苏柯汉(潍坊)生物有限公司。

日本岛津LC-20AT-DAD 高效液相系统，岛津UV-1800 紫外可见分光光度计;ALE-200 梅特勒电子天平，ZWY-110X30 型水浴摇床，PHS-3C 型pH计，H1650 高速台式离心机，HH-4 型数显恒温水浴锅，电热恒温鼓风干燥箱，SHB-3 型循环水多用真空泵，KQ5200DE 数控超声波清洗器，R-201D 旋转蒸发器。

1.2 分析方法

液相条件为:色谱柱为C18ODS 色谱柱(250 ×5 mm，5 μm)，柱温为30 ℃，甲醇∶水=35∶45(0.2%磷酸)为流动相，进样量10 μL，紫外吸收波长为280 nm，流速为1 mL/min。

精确称取HT 和OE 对照品5.7 mg 和4.5 mg一起置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解摇匀，并定容，密塞，得到浓度为0.57 mg/mL 和0.45 mg/mL的对照品混合标准母液。分别精密吸取此标准品溶液1、2、4、6、8、10、12、14、16 μL，自动进样，每个样品重复进样3 次，分别取HT 和OE 的HPLC 峰面积平均值。然后，以HPLC 峰面积为纵坐标，HT 和OE质量(μg)分别为横坐标，绘制HPLC 标准曲线，得出方程。采用液相分析法对酶解条件下(60 ℃，pH=5，酶解6 h)同一样品测定6 次，并计算测定结果的相对标准偏差，以评价该方法的精密度。

1.3 酶解方法

选取中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁酶、β-葡萄糖苷酶这10 种酶。称取相同酶活力的各种酶，在各种酶的最适pH(磷酸缓冲溶液，0.1 mol/L，50 mL)和最适温度下，分别对500 mg 油橄榄叶提取物酶解6 h。酶解结束后，90 ℃灭酶10 min，酶解液在5000 rpm 离心10 min，过滤，然后进行液相分析，得到OE 降解率和HT 含量。每次试验进行3 次，求其平均值。OE 降解率=1-酶解液OE 含量/提取物OE 含量(81.04%);HT 含量=酶解液HT 含量/提取物质量。

1.4 单因素试验

取500 mg 油橄榄叶提取物样品置于100 mL 锥形瓶，加入50 mL 缓冲溶液(磷酸缓冲溶液，0.1 mol/L)和一定量的半纤维素酶，在一定温度下酶解。酶解结束后，90 ℃灭酶10 min，酶解液在5000 rpm 离心10 min，过滤，用HPLC 分析滤液中HT 和OE，并根据标准曲线计算各含量。

以OE 降解率和HT 含量为检测指标，以油橄榄叶提取物为原料，对pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、温度(30、40、50、60、70、80 ℃)、时间(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)、酶底物比(1∶100、1∶50、1∶33.33、1∶25、1∶20、1∶10、1∶6.67、1∶5、1∶4、1∶3.33、1∶2.86、1∶2.5)进行单因素探索试验，研究不同因素对半纤维素酶水解OE 效率的影响。每次试验进行3 次，求其平均值。

1.5 响应面法中心组合设计

在单因素试验的基础上，为了考察各因素交互作用对油橄榄叶提取物酶解效率的影响及其影响因素的主次，并得到最佳酶解条件，采用中心组合设计，以pH、酶解温度、酶底物比这3 个独立变量为考察因素，利用Design-Expert 7.0 软件进行Box-Behnken 响应面设计，建立响应值与影响因素间的数学模型。试验设计见表1。

表1 响应面3 因素3 水平试验设计Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确定

以液相图谱峰面积为纵坐标，OE 和HT 质量为横坐标，分别得到各自的标准曲线。结果表明，OE在0.441～7.056 μg 内与其峰面积呈线性关系。并且在此范围内线性回归方程为y=1772846.78x +89802.31，相关系数R2=0.9997。HT 在0.5586～8.9376 μg 内与其峰面积呈线性关系，并且在此范围内线性回归方程为y=1199063.90x+119947.13，相关系数R2=0.9996。

液相分析OE 和HT 含量方法的相对标准偏差(RSD)分别为0.92%和1.38%，说明其分析方法精密度较高，重复性好。

2.2 酶种类的确定

从文献［15］可知，OE 降解为HT 需断裂糖苷键和酯键。酯的水解反应在酸性或者碱性条件下都可以进行，不需要特定的酶来水解。本实验主要针对糖苷键的断裂来选择有针对性、专一性的降解酶系。据作用机制得知，中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶［24］这6 种酶都会对糖苷键有一定的断裂作用。同时考察木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、单宁酶是否对糖苷键的断裂有很好的作用。

在相同酶活力的各种酶降解下，由图1 中可看出半纤维素酶的OE 降解率(91.04±1.25%)和HT含量(9.84±0.11%)都较高，其次为纤维素酶(65.94±1.35%，6.92±0.09%)和β-葡萄糖苷酶(56.37±1.95%，7.94±0.12%)。中性蛋白酶对OE 有着一定的降解效果(73.33±1.56%)，但HT含量(3.61±0.15%)却不高。木瓜酶(37.38±1.97%，4.24±0.12%)、单宁酶(20.85±1.82%，3.36±0.16%)、糖化酶(17.95±1.46%，3.11±0.17%)、β-葡聚糖酶(13.31±1.75%，2.93±0.12%)和中温淀粉酶(22.59±1.56%，3.92±0.12%)对油橄榄叶高含量OE 的降解效果都不理想，且碱性蛋白酶(8.03±1.73%，2.84±0.15%)的降解效率最差。故选半纤维素酶作为最佳酶种研究OE 的降解工艺。

图1 酶的种类对油橄榄叶提取物酶解效率的影响(n=3)Fig.1 Hydrolysis efficiency of different enzymes on olive leaf extracts (n=3)

图2 pH(A)、温度(B)、时间(C)及酶底物比(D)对油橄榄叶提取物酶解效率的影响(n=3)Fig.2 Effects of pH (A)，temperature (B)，time (C)and ratio of enzyme quantity and substrate (D)on enzyme hydrolysis efficiency of olive leaf extracts (n=3)

2.3 单因素实验

2.3.1 pH 对油橄榄叶提取物酶解效率的影响

当酶解温度60 ℃，时间6 h，酶底物比为1∶10，不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)对酶解效率的结果见图2(A)。OE 降解率和HT 含量都呈现出先增后减趋势，在pH=5 时最高，OE 降解率和HT 含量分别为99.07±0.83%和10.32±0.12%。在pH 为4 和7 时结果都不佳，尤其是pH 为7，说明半纤维素酶的酶解反应不适合偏碱性环境。所以选择4.5、5、5.5 为考察实验的水平参数。

2.3.2 酶解温度对油橄榄叶提取物酶解效率的影响

当pH5，时间6 h，酶底物比为1∶10，不同酶解温度(30、40、50、60、70、80 ℃)对酶解效率的结果见图2(B)。OE 降解率和HT 含量随着温度的增加呈现出增长趋势，在50 ℃时达到最大值之后，随着温度的升高两者都急剧下降，酶解效率显著下降，且80 ℃时酶活性很低。这可能由于半纤维素酶在80℃以上失去酶活力所致。所以选用40、50、60 ℃为考察实验的水平参数。

2.3.3 酶解时间对油橄榄叶提取物酶解效率的影响

当pH5，温度60 ℃，酶底物比为1∶10，不同时间(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)对酶解效率的结果见图2(C)。随着时间增加，OE 含量显著降低，HT 含量急剧增长。但在6 h 之后，OE 降解率反而降低了，而HT 含量还持续增长状态。可能由于之前OE降解的中间产物还未能及时地生成HT，故随着时间的延长其含量增加，但增长趋势不显著。HT 含量在4、5、6、7 h 变化不大，考虑到影响大小的原因，此因子不考虑为考察实验的水平参数。

2.3.4 酶底物比对油橄榄叶提取物酶解效率的影响

当pH5，温度60 ℃，时间6 h，不同酶底物比(1∶100、1∶50、1∶33.33、1∶25、1∶20、1∶10、1∶6.67、1∶5、1∶4、1∶3.33、1∶2.86、1∶2.5)对酶解效率的结果见图2(D)。OE 随着酶量的增加其降解率增加，但酶底物比1∶10 之后的OE 降解率变化不大。HT 含量在酶底物比1∶10 时最高，在此之后随着酶量的增加其含量降低。所以选1∶20、1∶10、1∶6.67 酶底物比作为实验的考察水平参数。

2.4 响应面法优化工艺条件

2.4.1 响应面试验结果

以HT 含量为响应值(Y)，进行Box-Behnken 3因素3 水平的设计，试验结果如表2 所示，方差分析 见表3、4。

表2 Box-Behnken 设计方案及响应值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding extraction yields

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of items in regression equation

从表3 可以看出，模型的F 值为14.98(P＜0.001)，表明方程达到极显著，模型能够用于真实实验数据的预测;而模型的失拟项F 值为20.12(P＜0.05)，表明方程失拟显著，固对此模型进行了手动优化，结果见表4。模型的F 值为113.34(P＜0.001)，表明方程达到极显著，模型能够用于真实实验数据的预测;模型的失拟项F 值为1.21(P＞0.05)，表明方程失拟不显著，计算数值与实测数值能较好拟合。系数(R2=0.9960)和校正系数(=0.9872)也是模型很重要的参数，其结果显示该模型有着很好的拟合关系。且信噪比(29.880)表明模型有着很好的信号。

在一次项中，X1pH 和X2温度对油橄榄叶提取物酶解为HT 含量的影响达到显著水平(P＜0.05)，在二次项中pH、温度和酶底物比对油橄榄叶提取物酶解为HT 含量的影响均达到极显著水平(P＜0.001);在交互项中，X1X2和X2X3发现对Y 值有显著性影响。综上所述，各因素对油橄榄叶提取物酶解过程的影响复杂，受多方面的影响，并非简单的线性关系。

各项因素对酶解后HT 含量的影响经回归拟合后得到二次多项回归模型为:

Y=11.16+0.20X1+0.39 X2+0.026X3+0.17X1X2+0.023X1X3+0.53X2X3–。式中，Y代表HT 含量(%);X1、X2and X3分别代表pH、温度和酶底物比。根据回归模型方程3 个因素前的拟合系数0.39＞0.20＞0.026 可知，3 个考察因素对酶解的影响大小为X2(温度)＞X1(pH)＞X3(酶底物比)，pH 和温度是酶解过程中主要因素。

表4 手动优化的回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of items in regression equation by manual optimization

2.4.2 响应曲面图分析

由图3 可见，3 个交互项中X1X2、X2X3存在较为显著的交互作用，表现为响应曲面的等高线图呈椭圆状，这说明:pH 与温度这两个因素存在相互影响，当pH 值小时，即酸性相对强时，可将OE 降为HT，此时不需要很高温度，反之，当pH 值大时，即酸性相对弱时，较高温度可以更好地降解OE;酶解温度与酶底物比亦存在较为明显的相互作用，这说明当提取温度较低时，加大酶的用量(酶底物比小)可有效提高HT 含量，而当酶解温度较高时，酶的活性也增加，同时为了防止酶活性过高继而破坏酚类物质的结构，必须适当减少酶的质量(酶底物比大)。交互项X1X3的等高线形状偏向于圆形，表明pH 与酶底物比这两项的交互作用并不显著，说明这两者相互作用对酶解产物含量的影响较小。上述分析与模型回归的方差分析基本一致。

图3 各因素交互作用对HT 含量的影响Fig.3 Response surface plots and contour plots showing mutual effects of different factors on HT content

2.4.3 优化与验证实验

通过上述回归模型分析并计算得到半纤维素酶水解油橄榄叶提取物的最佳工艺条件为:油橄榄叶提取物(81.04% OE)500 mg，pH 5.06，温度54.80℃，酶底物比为1∶9.1，时间6 h。考虑到实际实验和生产的可操作性，将以上最优参数分别调整为pH 5，温度55 ℃，酶底物比为1∶9.1，并据此进行结果验证。平行测定3 次所获HT 含量为(11.31±0.15)%，OE 的降解率为98.54±1.63%。与模型预测值(11.28%)的相对标准偏差为1.33%＜5%，说明经该模型推测得到的最佳工艺参数对实际操作的预测较为可靠，有一定指导意义。

Briante 等［16］利用固定化的嗜高温β-葡萄糖苷酶(pH=7.0，60 ℃)降解OE(橄榄叶提取物)，并从复杂的酶解物中分离出91%～94%以上的HT。此方法采用的橄榄叶提取物中OE 含量为37.7%，且可得到42.3 mg/100 mg 产物。说明嗜高温β-葡萄糖苷酶对橄榄苦苷的降解效果很好，且固定化之后酶活更高。卜文文等［23］认为橄榄叶中OE 水解为HT 的盐酸法比酶解法效果好，且酸解后HT 含量为7.83%、酶解为3.91%。这可能由于此实验使用常温且酶活低的β-葡萄糖苷酶水解的缘故。相比之下，其酶解结果没有本实验结果高，但和本实验2.2中常温β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶的酶解效果结果一致。本实验选用的酶种β-葡萄糖苷酶是常温的(37 ℃)，效果有但不是最好;其次本实验使用的纤维素最适温度为45 ℃，半纤维素的最适温度为45～60 ℃，且纤维素和半纤维素中都还有β-葡萄糖苷酶系。所以由此可以看出，温度对酶解OE 有着很大的决定作用，且本实验所选酶种中半纤维酶的酶解效果最好。

3 结论

半纤维素酶对油橄榄叶提取物的OE 有着很好的降解作用，且对影响其酶解效果的pH、温度、时间、酶底物比4 个因素分别进行了考察。在此基础上对pH、温度和酶底物比进行3 因素3 水平的Box-Behnken 响应面分析，建立了以HT 含量为响应值的数学模型:Y=11.16+0.20X1+0.39 X2+0.026X3+0.17X1X2+0.023X1X3+0.53X2X3–，模型回归方程显著，可用于实际预测。

通过响应面法优化半纤维素酶水解油橄榄叶提取物的最佳工艺条件为:油橄榄叶提取物(81.04%OE)500 mg，pH 5，温度55 ℃，酶底物比为1∶9.1，时间6 h。在此酶解工艺下，HT 含量为为11.31%，OE降解率为98.54%。

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