左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马血脑屏障精细结构AQP4、Cx43 的影响

王宇红， 谭小雯， 曾 嵘， 柴 上， 杨 蕙， 孟 盼， 张秀丽

(1. 湖南中医药大学，湖南长沙410007;2. 湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南长沙410007;3. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007)

糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱症，并且抑郁症已被确认为糖尿病又一并发症。在我国约有51%的糖尿病患者存在不同程度的抑郁症［1］。目前，糖尿病并发抑郁症的研究多集中于临床，对于血脑屏障的研究鲜有报道，且实验研究对象多以海马神经元为主。有文献报道，糖尿病能破坏血脑屏障［2］，而修复损伤的血脑屏障对于保护神经元有积极作用［3］。血脑屏障是由四个部分组成:毛细血管内皮细胞及其间紧密连接，内皮基膜，星形胶质细胞终足和周细胞。水通道蛋白AQP4、缝隙连接蛋白Cx43 表达于星形胶质细胞终足上，构成了血脑屏障的精细结构［4-5］，对维持血脑屏障内环境稳定有重要意义。以AQP4、Cx43 为标志的血脑屏障损伤是否参与了糖尿病并发抑郁症的发生发展，还未见报道。左归降糖解郁方是以张仲景的古方左归饮、左归丸化裁而得的左归降糖方为基本方，再加入行气活血、疏肝解郁的姜黄、贯叶金丝桃组成的“左归降糖解郁方”［6］。因此，本实验研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马血脑屏障精细结构AQP4、Cx43 的影响，不但对深入了解糖尿病并发抑郁症的发病机制有重要意义，而且为开发新药提供了新的思路。

1 材料与仪器

1.1 药品 左归降糖解郁方的组成药物为黄芪18 g、贯叶连翘3 g、姜黄9 g、熟地黄15 g、山茱萸12 g、枸杞12 g、菟丝子9 g、杜仲9 g、丹参12 g、丹皮6 g、牛膝9 g，原材料购自湖南中医药大学第一附属医院。盐酸二甲双胍片(规格0.25 g，批号1402115，湖南湘雅制药有限公司);百忧解(盐酸氟西汀胶囊，20 mg，批号2087A，法国Patheon)。

1.2 试剂 链脲佐菌素(STZ) (美国Sigma 公司);兔抗大鼠AQP4、Cx43 多克隆抗体(武汉博士德有限公司);高脂乳剂组成:10% 胆固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%猪油、2%胆酸钠、20%聚山梨酯80、20%丙二醇，加蒸馏水至100 mL。

1.3 动物 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量180 ～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK (湘)2013-0004;合格证号43004700004535。实验前适应性饲养3 d，动物自由摄食与饮水。

1.4 仪器 One Touch Ⅱ血糖仪及血糖试纸(美国强生公司)，动物行为学习记忆系统(法国Viewpoint 公司)，Olympus 生物显微镜(日本OLYMPUS公司)，DVP-W7 显微镜图像处理系统(南京长城信息系统公司)，RM223 切片机(德国莱卡公司)。

2 方法

2.1 糖尿病并发抑郁症动物模型的制备［7-8］SD大鼠以高脂乳剂10 mL/kg 连续灌胃14 d，每天1次，末次灌胃后，大鼠禁食不禁水24 h，一次性尾静脉注射STZ (溶于新鲜配制的0.1 mol/L、pH 4.5 枸橼酸缓冲液中，4 ℃保存)38 mg/kg，空白组大鼠1 次性尾静脉注射0.1 mol/L、pH 4.5 枸橼酸缓冲液，体积为2 mL/kg。造模3 d 后，大鼠禁食不禁水6 h，测定空腹血糖，从中选取空腹血糖≥16.00 mmol/L 的大鼠为糖尿病模型。继续给予糖尿病模型动物慢性应激，具体包括4 ℃冰水浴5 min、45 ℃热刺激5 min、倾笼45° 24 h、噪音8 h、昼夜颠倒24 h、潮湿垫料(200 mL/笼，24 h)、夹尾1 min，每天采用1 种刺激，同种刺激不连续出现，共刺激28 d。成模后，糖尿病并发抑郁症大鼠空腹血糖始终≥16.00 mmol/L，下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能紊乱致血浆皮质酮的量升高，Open-field 实验中大鼠水平活动及垂直活动减少，Morris 水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期延长。

2.2 分组与给药 50 只造模大鼠随机分为5 组:模型组，阳性药(二甲双胍0.18 g/kg +盐酸氟西汀1.8 mg/kg)组，左归降糖解郁方高、中、低剂量(32.82、16.41、8.20 g/kg)组。另取10 只SD 大鼠作为空白组。各组大鼠于造模同时灌胃给药，共28 d，空白组和模型组给予等体积生理盐水。

2.3 Morris 水迷宫实验 Morris 水迷宫操作系统:直径为1.5 m 的圆形水池，平台直径为0.15 m，水深0.4 m，平台置于迷宫西南象限。水面高出平台3 cm，水温保持(24 ±1)℃。

给药后，对6 组大鼠进行水迷宫训练，训练5 d，记录逃避潜伏期，考查学习能力。

2.4 样本采集 大鼠麻醉后左心室灌注生理盐水，剪开右心耳，以便将脑血管内的血液冲出。待流出液澄清后，4%多聚甲醛灌注固定1 h，取全脑，放入4%多聚甲醛液中固定，常规脱水，石蜡包埋切片，一部分常规HE 染色，另一部分免疫组化监测。

2.5 海马组织病理学检测 常规石蜡包埋切片后，4 μm 连续切片，进行HE 染色，光镜下观察海马组织病理学改变并比较。

2.6 免疫组织化学检测AQP4、Cx43 的表达 采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法，操作严格按照试剂盒说明进行。操作如下:上述石蜡切片常规脱蜡、水化，用新鲜配置3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，PBS 洗3 次各5 min。将切片浸入0.01 mol/L 枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，微波加热至沸腾后断电，待自然冷却后，PBS 洗2 次各5 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min。甩去多余液体。分别滴加兔抗大鼠AQP4、Cx43 I抗50 μL，4 ℃过夜，37 ℃复温45 min，PBS 洗3次各5 min。滴加II 抗50 μL，室温孵育30 min，PBS 洗3 次各5 min。滴加SABC，室温孵育30 min PBS 洗3 次各5 min。DAB 显色，在显微镜下控制显色时间5 ～10 min，自来水冲洗10 min。苏木精轻度复染2 min，最后脱水、透明、封片。显微镜下观察每张玻片海马部位AQP4、Cx43 的表达情况，阳性细胞为棕褐色。观察3 个不同的视野，计算积分光密度值。

2.7 统计学处理 数据分析采用统计软件SPSS 16.0，所有计量资料以±s 表示，组间采用单因素方差分析 (One-way-ANOVA)，t 检验，双侧检验。

3 结果

3.1 各组大鼠逃避潜伏期比较 与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，差异有显著意义(P ＜0.01)。与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠逃避潜伏期显著缩短，差异有显著意义(P ＜0.01)，提示阳性药和左归降糖解郁方高剂量能显著改善糖尿病并发抑郁症大鼠空间学习能力。结果见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期情况(±s，n=10)Tab.1 Rats’escape latency in each group (±s，n=10)

表1 各组大鼠逃避潜伏期情况(±s，n=10)Tab.1 Rats’escape latency in each group (±s，n=10)

注:与空白组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 剂量 逃避潜伏期/s空白组22.50 ±17.55模型组 80.80 ±18.12＊＊阳性药组 二甲双胍0.18 g/kg+盐酸氟西汀1.8 mg/kg 27.18 ±23.57##左归降糖解郁方高剂量组 32.82 g/kg 33.00 ±21.79##左归降糖解郁方中剂量组 16.41 g/kg 58.00 ±33.37左归降糖解郁方低剂量组8.20 g/kg 76.70 ±21.78

3.2 各组大鼠海马组织病理学比较 空白组大鼠海马椎体细胞形态正常，排列正常。与空白组比较，模型组大鼠海马椎体细胞存在损伤，表现为锥体细胞胞体固缩，深染及空泡变性。与模型组比较，阳性药和左归降糖解郁方高剂量组大鼠海马细胞空泡细胞数量减少，少见细胞肿胀;而左归降糖解郁方中剂量组和低剂量对海马细胞形态损伤改善能力较弱。结果见图1。

3.3 各组大鼠海马血脑屏障精细结构AQP4 表达比较 与空白组比较，模型组大鼠AQP4 积分光密度值减少，提示AQP4 表达下降，差异有统计学意义(P ＜0.05)。与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组AQP4 积分光密度值增加，提示AQP4 表达上升，差异有统计学意义 (P ＜0.05)。结果见表2，图2。

3.4 各组大鼠海马血脑屏障精细结构Cx43 表达比较 与空白组比较，模型组大鼠Cx43 积分光密度值减少，提示Cx43 表达下降，差异有统计学意义(P ＜0.05)。与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组Cx43 积分光密度值增加，提示Cx43 表达上升，差异有统计学意义(P ＜0.05)。结果见表3，图3。

图1 各组海马组织HE 染色结果(×400)Fig.1 Images of hippocampal HE staining in each group (×400)

表2 各组大鼠海马AQP4 免疫阳性积分光密度值比较(±s，n=10)Tab.2 Comparison of AQP4 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

表2 各组大鼠海马AQP4 免疫阳性积分光密度值比较(±s，n=10)Tab.2 Comparison of AQP4 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

注:与空白组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别剂量 积分光密度值空白组1.89 ±0.99模型组 - 0.38 ±0.26*阳性药组 二甲双胍0.18 g/kg+盐酸氟西汀1.8 mg/kg 1.40 ±0.39#左归降糖解郁方高剂量组 32.82 g/kg 1.13 ±0.50#左归降糖解郁方中剂量组 16.41 g/kg 0.48 ±0.14左归降糖解郁方低剂量组-8.20 g/kg 0.44 ±0.13

图2 各组海马血脑屏障精细结构AQP4 免疫组化染色结果(×400)Fig.2 Images of AQP4 immunohistochemical staining in hippocampal BBB’s fine structure in each group (×400)

表3 各组大鼠海马Cx43 免疫阳性积分光密度值比较(±s，n=10)Tab.3 Comparison of Cx43 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

表3 各组大鼠海马Cx43 免疫阳性积分光密度值比较(±s，n=10)Tab.3 Comparison of Cx43 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

注:与空白组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别剂量 积分光密度值空白组1.46 ±0.64模型组 - 0.46 ±0.03*阳性药组 二甲双胍0.18 g/kg+盐酸氟西汀1.8 mg/kg 0.96 ±0.27#左归降糖解郁方高剂量组 32.82 g/kg 0.75 ±0.21#左归降糖解郁方中剂量组 16.41 g/kg 0.53 ±0.46左归降糖解郁方低剂量组-8.20 g/kg 0.43 ±0.34

图3 各组海马血脑屏障精细结构Cx43 免疫组化染色结果(×400)Fig.3 Images of Cx43 immunohistochemical staining in hippocampal BBB’s fine structure in each group (×400)

4 讨论

高脂乳剂灌胃、尾静脉注射链脲佐菌素(STZ，38 mg/kg)、28 d 慢性应激联合的方法可成功复制糖尿病并发抑郁症大鼠模型。本课题组前期研究表明［7］应用该造模方法后，大鼠空腹血糖始终≥16.00 mmol/L，HPA 轴功能紊乱，行为学上出现自主活动度降低、对新鲜环境好奇度降低及严重的认知功能障碍，可从生理和心理双重角度模拟糖尿病并发抑郁症临床发病过程。

血脑屏障是中枢神经系统特有的重要结构，中枢神经系统功能稳定依赖血脑屏障功能完整。AQP4、Cx43 表达于星形胶质细胞终足上，构成了血脑屏障的精细结构，对维持血脑屏障内环境稳定有重要意义。

水通道蛋白是一类介导跨膜水运输的内在蛋白，AQP4 主要于神经系统中的星形胶质细胞胞膜和胞浆高度表达，可调节细胞外间隙中水和K+的浓度［9］，对于维持中枢内环境平衡有着举足轻重的地位。文献报道糖尿病大鼠血脑屏障损伤，电镜下可观察到星形胶质细胞终足存在明显水肿［10］。本研究发现，与空白组大鼠相比，糖尿病并发抑郁症大鼠AQP4 表达减少。而与模型组大鼠相比，阳性药 (二甲双胍0.18 g/kg + 盐酸氟西汀1.8 mg/kg)组与左归降糖解郁方高剂量组大鼠AQP4表达增加。因此，我们推测AQP4 的减少使水分子滞留于星形胶质细胞内，进而导致细胞肿胀。左归降糖解郁方通过调控AQP4 的表达，维持了中枢神经系统内环境的稳态，可能成为潜在的治疗机制之一。

缝隙连接蛋白是中枢神经系统内细胞间进行信息和物质交流的基础，而星形胶质细胞终足间存在大量缝隙连接，其中Cx43 是主要的缝隙连接蛋白［5］。有研究认为Cx43 是维持血脑屏障完整性必需的，表达减少可引起星形胶质细胞足突水肿，血脑屏障功能下降［11］。本研究发现，与空白组大鼠相比，糖尿病并发抑郁症大鼠Cx43 表达减少。而与模型组大鼠相比，阳性药组与左归降糖解郁方高剂量组大鼠Cx43 表达增加。因此，我们推测Cx43的减少使血脑屏障完整性被破坏，与AQP4 的量变化共同加剧了中枢内环境紊乱及血脑屏障损伤。

本实验光镜下，HE 染色可见模型组大鼠海马存在损伤，左归降糖解郁方高剂量可对损伤的海马细胞产生较好的保护作用。Morris 水迷宫测试行为学的结果表明糖尿病并发抑郁症大鼠存在严重的认知功能障碍，而左归降糖解郁方能改善其认知功能。结合AQP4、Cx43 免疫组织化学的结果，我们推测左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠的治疗作用可能与调控海马血脑屏障精细结构AQP4、Cx43 表达有关。本研究发现给予糖尿病并发抑郁症大鼠左归降糖解郁方干预后，大鼠血脑屏障精细结构AQP4、Cx43 表达紊乱的情况得到缓解，可能为治疗糖尿病并发抑郁症开辟新的思路。

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