对羟基苯甲醇对急性脑缺血损伤大鼠脑内炎症因子的影响

蒋 石， 刘姗姗， 向 彬， 林 青， 李秀芳

(云南中医学院，云南 昆明650500)

缺血性脑卒中是当今死亡率和致残率较高的疾病之一，在其复杂的病理机制中，神经炎症(neuroinflammation)被认为是最重要的病理生理机制之一，减轻神经炎症有望成为继溶栓疗法之后又一 重 要 的 治 疗 策 略［1］。天 麻 (Gastrodia elata Blume)是我国名贵中药，主产于云南、四川、贵州、陕西等地，具有平肝、息风、通血脉、开窍等功效，临床用于高血压等疾病的治疗取得较好疗效［2］。文献及课题组前期的研究均表明，天麻具有显著的抗脑缺血再灌注损伤［3］及抗炎作用［4］，对羟基苯甲醇 (4-hydroxybenzyl alcohol，4-HBA)为其主要活性成分之一，有证据表明，对羟基苯甲醇可通过对抗氧化应激损伤、兴奋性氨基酸毒［5］等途径减轻脑缺血损伤，对羟基苯甲醇在体外可抑制脂多糖刺激的BV-2 小胶质细胞炎症反应［6］，但该作用在体内是否与对羟基苯甲醇抗脑缺血损伤有关尚不十分清楚，因此，本实验从抑制大鼠急性脑缺血后的炎症反应角度对天麻成分对羟基苯甲醇的抗脑缺血损伤作用机制进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 对羟基苯甲醇(北京百灵威科技有限公司，批号 G6B21-CM);花生四烯酸(Arachidonic Acid，AA) (美国Sigma 公司，批号SLBJ3652V);地塞米松(大连美仑生物公司，批号20131215);吐温-80 (国药集团化学试剂有限公司，批号090711);水合氯醛(天津市百世化工有限公司，批号20100813);Rat TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒 (联科生物技术有限公司);Rat TXA2、6-keto-PGF1α、CysLTs、LTB4ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物分组、动物模型制备及给药 清洁级雄性SD 大鼠，体质量240 ～280 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供(合格证号SCXK［川］2013-24;批号0018160)。大鼠随机分为5 组，即假手术组、模型组(灌胃给予1%吐温-80)、地塞米松组(20 mg/kg 灌胃)、对羟基苯甲醇高剂量组(20 mg/kg 灌胃)、对羟基苯甲醇低剂量组(10 mg/kg灌胃)。给药体积均为1 mL/100 g 体质量，1 次/d，连续7 d。末次给药后1 h，参照文献方法［7-8］，复制大鼠急性脑缺血模型:大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分离右侧颈总动脉并结扎其颈外动脉分支和颈总动脉近心端，于右颈总动脉远心端插入导管，经导管向右颈总动脉以0.1 mL/100 g体质量注入0.5 mg/kg 的AA。

1.3 大鼠神经功能损伤程度评估 参考文献［9-10］的方法，对脑缺血3 h 大鼠进行神经功能评分。无神经损伤症状，0 分;不能完全伸展对侧前爪，1 分;向对侧转圈，2 分;向对侧倾倒，3 分;不能自发行走，意识丧失，4 分;死亡，5 分。

1.4 ELISA 检测脑匀浆中TNF-α、IL-1β、TXA2、6-keto-PGF1α、CysLTs、LTB4的量 脑缺血3 h 后处死大鼠，取脑，于冰浴中用电动匀浆器制备脑组织匀浆，3 000 r/min 离心后10 min 获得上清，将标准蛋白样品和待测脑匀浆上清液加入包被好一抗的96 孔板，按试剂盒说明书步骤操作，测定OD值，根据已知浓度的标准蛋白的OD 值绘制标准曲线，根据标准曲线计算得脑匀浆上清液中的TNFα、 IL-1β、 TXA2、6-keto-PGF1α、 CysLTs、 LTB4的量。

2 结果

2.1 天麻成分对羟基苯甲醇可减轻大鼠急性脑缺血模型神经功能损伤 假手术组大鼠未见神经功能障碍，模型组大鼠脑缺血3 h 后，神经功能损伤评分明显增高，对羟基苯甲醇(20 mg/kg)可显著改善急性脑缺血模型大鼠神经病学症状(表1)。

表1 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型神经功能损伤评分的影响(±s，n=8)Tab.1 Effect of 4-HBA on neurologic scores of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表1 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型神经功能损伤评分的影响(±s，n=8)Tab.1 Effect of 4-HBA on neurologic scores of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:与假手术组比较，## P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 剂量/(mg·kg -1)神经学评分假手术组 —0.00 ±0.00模型组 — 3.14 ±1.07##对羟基苯甲醇高剂量组 20 1.67 ±0.52*对羟基苯甲醇低剂量组 10 1.75 ±1.50地塞米松组 20 1.67 ±1.37*

2.2 天麻成分对羟基苯甲醇可降低大鼠急性脑缺血模型脑组织TNF-α、IL-1β 的量 大鼠颈内动脉注入AA 诱导血栓形成造成急性脑缺血后，脑组织中TNF-α 和IL-1β 的量显著升高，对羟基苯甲醇(20 mg/kg)可 显 著 降 低TNF-α 和IL-1β 水 平(表2)。

2.3 天麻成分对羟基苯甲醇可减轻大鼠急性脑缺血模型脑组织TXA2和6-keto-PGF1α的量 大鼠颈内动脉注入AA 诱导血栓形成造成急性脑缺血后，脑组织中TXA2和6-keto-PGF1α水平显著升高，对羟基苯甲醇(20、10 mg/kg)可明显降低两者的量(表3)。

表2 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型脑组织TNF-α、IL-1β 量的影响(±s，n=8)Tab.2 Effect of 4-HBA on levels of TNF-α and IL-1β in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表2 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型脑组织TNF-α、IL-1β 量的影响(±s，n=8)Tab.2 Effect of 4-HBA on levels of TNF-α and IL-1β in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:与假手术组比较，## P ＜0.01;与模型组比较，＊＊P ＜0.01

组别 剂量/(mg·kg -1) TNF-α/(pg·mL -1) IL-1β/(pg·mL -1)620.28 ±261.66 1149.27 ±934.07模型组 — 1459.80 ±448.24## 5281.10 ±357.00##对羟基苯甲醇高剂量组 20 518.32 ±223.99＊＊ 2622.94 ±1533.57＊＊对羟基苯甲醇低剂量组 10 1284.37 ±441.29 4908.30 ±934.46地塞米松组 20 477.20 ±121.65＊＊ 2173.71 ±715.60假手术组 —＊＊

表3 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型脑组织TXA2 和6-keto-PGF1α量的影响(±s，n=8)Tab.3 Effect of 4-HBA on levels of TXA2 and 6-keto-PGF1α in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表3 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型脑组织TXA2 和6-keto-PGF1α量的影响(±s，n=8)Tab.3 Effect of 4-HBA on levels of TXA2 and 6-keto-PGF1α in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:与假手术组比较，## P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 剂量/(mg·kg -1) TXA2/(pg·mL -1) 6-keto-PGF1α/(pg·mL -1)43.17 ±23.27 78.81 ±68.03模型组 — 155.01 ±48.36## 189.45 ±45.94##对羟基苯甲醇高剂量组 20 99.29 ±32.06* 95.21 ±52.90＊＊对羟基苯甲醇低剂量组 10 95.08 ±60.64* 118.21 ±55.66*地塞米松组 20 144.20 ±51.16 129.23 ±29.95假手术组 —*

2.4 天麻成分对羟基苯甲醇对大鼠急性脑血栓模型脑组织LTB4和CysLTs 的量无明显影响 大鼠颈内动脉注入AA 诱导血栓形成造成急性脑缺血后，脑组织中LTB4和CysLTs 水平显著升高，但对羟基苯甲醇对两指标的量无明显影响(表4)。

表4 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型脑组织LTB4和CysLTs 量的影响(±s，n=8)Tab.4 Effect of 4-HBA on levels of LTB4 and CysLTs in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表4 对羟基苯甲醇对大鼠急性脑缺血模型脑组织LTB4和CysLTs 量的影响(±s，n=8)Tab.4 Effect of 4-HBA on levels of LTB4 and CysLTs in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:与假手术组比较，## P ＜0.01

组别 剂量/(mg·kg -1) LTB4/(ng·L -1) CysLTs/(ng·L -1)233.86 ±162.80 20.72 ±13.46模型组 — 481.34 ± 104.17## 216.09 ±35.68##对羟基苯甲醇高剂量组 20 464.30 ± 150.50 182.59 ±61.34对羟基苯甲醇低剂量组 10 346.75 ± 165.90 181.61 ±86.08地塞米松组假手术组 —20 465.40 ± 121.13 181.54 ±44.36

3 讨论

研究证据表明，兴奋性氨基酸毒［11］、氧化应激［12］、炎症反应［13］、钙超载14］、细胞凋亡［15］等病理机制参与了脑缺血损伤过程，炎症反应和细胞凋亡属于脑缺血损伤的早期事件［16］。脑缺血后的神经炎症反应是缺血性脑血管疾病病理过程的重要组成部分，也是加重脑缺血损害的潜在因素［17］。正常情况下，神经炎症是一个有益的过程，一旦威胁消除或内环境恢复稳态后便会自行停止，然而在脑缺血等病理状况下，脑组织可出现急性和迟发性炎症反应，持续的神经炎症过程会触发一系列信号级联反应，引起脑内氧化应激和炎症分子水平升高，增加了神经元的易损性，破坏血脑屏障，造成脑缺血后的继发性损伤，最终导致神经元损伤或死亡。脑缺血后，细胞膜磷脂在磷脂酶A2 的作用下，释放大量游离的AA，AA 在其限速酶——COX 和5-LO 催化下生成炎症因子前列腺素(prostaglandins，PGs)及白三烯类(leukotriene，LTs)，COX-2 及COX 途径下游的炎症因子PGs 在脑缺血损伤病理过程中发挥了极为重要的作用［18］，而AA代谢的5-LO 途径也参与了脑缺血后的炎症损伤过程［19］。5-LO 途径的代谢产物CysLTs 与其受体结合后，可调节多种炎症过程，如血管平滑肌痉挛、毛细血管通透性增加、过敏反应等，LTBs 是目前已知趋化作用最强的趋化因子，可激活白细胞和其他炎症细胞向炎症部位移动。

课题组前期的研究提示，天麻成分对羟基苯甲醇具有较强的抗急性脑缺血损伤作用，可降低血脑屏障的通透性(另文报道)，同时，在一项采用大鼠皮下注射AA 或角叉菜胶引起踝关节水肿模型，对天麻成分对羟基苯甲醇的抗炎作用进行的研究中发现，对羟基苯甲醇具有很强的抗炎作用，且其作用机制主要为抑制AA 代谢的COX 途径而达到，结合两项研究的结果及文献关于对羟基苯甲醇可对抗脂多糖(LPS)刺激的小胶质细胞炎症反应的报道，推测对羟基苯甲醇是否可通过减轻神经炎症反应而对抗脑缺血损伤?为证实此推测，本实验采用大鼠颈内动脉注射血栓诱导剂AA，诱发同侧大脑半球脑血栓形成的方法，制备大鼠急性脑缺血模型，以大鼠出现脑缺血损伤的神经病学症状评分及ELISA 法检测大鼠脑组织匀浆液中炎症因子释放水平，对对羟基苯甲醇的作用机制进行了评价，结果表明，对羟基苯甲醇可明显改善大鼠神经病学症状，显著降低TNF-α、IL-1β 的水平，具有较强的抗炎作用。为进一步探讨在脑缺血损伤模型中对羟基苯甲醇是通过抑制COX 途径还是5-LO 途径达到抗炎作用。于是对脑组织匀浆中两条代谢途径的下游炎症因子进行了检测，结果显示，对羟基苯甲醇对5-LO 途径的白三烯类炎症因子LTB4和CysLTs释放作用不明显，而对COX 途径的TXA2、6-keto-PGF1α均有明显的抑制作用，提示天麻成分对羟基苯甲醇主要是通过抑制AA 代谢的COX 途径，而达到减轻脑缺血损伤后的炎症反应，其深入的作用机制尚待进一步研究。

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