HPLC 波长切换法测定主产区与道地产区牡丹皮中的4 种成分

张 伟， 刘信秋， 吴德玲* ， 金传山， 方成武， 赵宏苏， 刘颈松，许凤清

(1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230031;2. 安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥230031;3. 安徽省中医药科学院药物化学研究所，安徽合肥230031;4. 亳州市华佗中医院，安徽亳州236800)

牡丹皮为芍药科植物凤丹Paeonia ostii T. Hong et J. X. Zhang 的干燥根皮，其性微寒，味苦、辛，具有清热凉血，活血化瘀之功效［1-2］，主产于安徽铜陵、南陵、亳州，山东菏泽，重庆垫江、灌县，四川等地。现代研究表明，牡丹皮中主要含有丹皮酚、酚苷类、单萜及其苷类成分，另外还有三萜、甾醇、黄酮、有机酸、香豆素等［3-6］。

目前，铜陵产“凤丹皮”是传统道地药材，但目前市场上流通量最大、最常用的为亳州丹皮［7］。牡丹皮作为新引入亳州的中药材是否值得推广，不仅要看它的适应情况和产量，更要关注其质量，以引导该药材的合理种植和优质生产。前期人们已对不同产地［8-10］、年限［11］、部位牡丹皮有效成分的含有量进行过相关报道，发现不同产地该药材的质量有一定差异，并且同一产地不同生长年限其质量也有所不同［12-16］，其中没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚是牡丹皮中的主要代表性成分和活性物质［3-4］。因此，本实验以这4 种成分为指标，考察亳州、铜陵不同年限牡丹皮中有效成分的含有量，以比较目前市场上主产区与道地产区该药材的差异性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 HPLC 色谱仪 (包括G1316A 柱温箱、G1329B 自动进样器、VWD 检测器检测器、ChemStation 色谱工作站)、ZORBAX SB-C18色谱柱(美国Agilent 公司);AUW220D 电子天平(十万分之一，日本岛津公司);AS3120超声波清洗器(120 W、40 KHz，天津奥特塞恩斯仪器有限公司)

1.2 材料

1.2.1 对照品 没食子酸(批号110831-201204，中国食品药品检定研究院，纯度为98%);氧化芍药苷(批号120317，成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98%);芍药苷(批号110736-201337，中国食品药品检定研究院，纯度为95%);丹皮酚(实验室自制，纯度为98%)。甲醇为色谱纯(美国Tedia 公司);水为娃哈哈纯净水;其余试剂均为分析纯。

1.2.2 样品 铜陵丹皮于2013 年10 月上旬采自北京同仁堂铜陵金凤乡丹皮种植基地，不同年限(3、4、5 年)各采3 棵;亳州丹皮于2013 年10月中旬采自亳州十八里中药材种植基地，不同年限(3、4、5、6、7 年)各采3 棵。样品采集后，去除木心，晾干，打粉，过40 目筛备用，并且由安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定，均为芍药科凤丹Paeonia ostii. T. Hong et J. X. Zhang 的 干燥根皮。

2 方法及结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚对照品0.40、5.95、3.52、9.84 mg，加50%甲醇溶解，定容至10 mL，得质量浓度分别为0.040、0.595、0.352、0.984 mg/mL 的对照品溶液，再将其按1 ∶1 ∶1 ∶1 比例混合，即得质量浓度分别为 0.010、0.149、0.088、0.246 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取本品粗粉1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声(120 W、40 kHz)1 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。再精密量取续滤液2 mL，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm 滤膜，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 采用Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);甲醇(A)-0.05%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0 ～10 min，90%B;10 ～30 min，90% ～70%B;30 ～40 min，70%B;40 ～45 min，70% ～45%B;45 ～55 min，45%B;55 ～60 min，45% ～90%B;60 ～70 min，90% B);体积流量为 1.0 mL/min;检测波长分别为270 nm (0 ～15 min，没食子酸)、230 nm (15 ～40 min，氧化芍药苷和芍药苷)、274 nm (40 ～70 min，丹皮酚);柱温为25 ℃;进样量为20 μL。在此色谱条件下，取供试品、对照品溶液适量，分别进样20 μL 测定，发现这4 种成分均能完全分离，两者的HPLC 色谱图见图1。

图1 对照品与供试品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，在“2.3”项色谱条件下进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，各成分进样量(μL)为横坐标(X)，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 4 种对照品的线性关系Tab.1 Linear relationships of four reference substances

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续进样6 次，测定峰面积。结果，没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的峰面积RSD(n=6)分别为0.2%、0.5%、0.7%、0.4%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样20 μL 测定。结果，没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的峰面积RSD (n = 6) 分 别 为 1.2%、1.8%、1.3%、0.2%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取丹皮样品粗粉6 份，每份1 g，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，进样20 μL 测定。结果，没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚含有量的平均值(n =6)分别为0.233%、1.207%、1.067%、2.378%，RSD分别为0.1%、0.9%、1.1%、0.3%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取没食子酸对照品7.50 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀备用;分别精密称取氧化芍药苷、芍药苷对照品15.24、14.82 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀备用;精密称取丹皮酚对照品20.40 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀备用。然后，取含有量已知的亳州5 年生牡丹皮粉末6 份，每份约0.1 g，分别加入与样品等量的各对照品溶液，按“2.2”项下方法制备，然后进样测定，计算加样回收率，结果见表2，表明回收率良好。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Result of recovery tests

2.9 样品测定 取不同产地及年限的牡丹皮粗粉适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，重复3 次，在“2.3”项色谱条件下进样20 μL，测定没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的平均含有量(n=3)，结果见表3。

表3 牡丹皮样品中4 种成分含有量测定结果Tab.3 Result of determination of the contents of four constituents in Moutan Cortex samples

3 讨论

本实验采用HPLC 波长切换法，测定了主产区与道地产区牡丹皮中没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、丹皮酚的含有量，并保证各成分在检测波长处均有稳定的基线和紫外吸收。同时，还考察了不同溶剂(50%、70%、90%、100%甲醇)及提取时间，发现以50%甲醇为溶剂提取1 h 时，效果最理想。

结果显示，亳州(主产区)和铜陵(道地产区)的牡丹皮在生长过程中，除没食子酸含有量呈下降趋势外，氧化芍药苷、芍药苷和丹皮酚等均呈上升趋势。另外，在样品采集时发现，两地药材采收年限的差异明显，铜陵地区一般在生长5 年时采收，少数在4 年时采收，而亳州地区一般在生长6 年后采收，5 年以下者通常不采收，但两地采收的牡丹皮质量基本相当。由此可知，在亳州引种推广牡丹皮药材是可行的。

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