肾脑复元汤对脑缺血大鼠BDNF 及bFGF 表达的影响

胡国恒， 李映辰 ， 程齐来， 范金花， 陈韵羽， 张忠伟

(1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007;2. 湖南中医药大学，湖南长沙410208;3. 邵阳市中医院，湖南邵阳422001;4. 郑州市中医院，河南郑州450002)

缺血性中风，是指各种原因引起的局部脑组织血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧坏死，从而产生的一系列临床神经功能缺损综合征［1］。在本病的治疗上，除进行超早期(发病4.5 h 内)溶栓以外，其他脑保护治疗措施尚未得到公认，临床上也缺乏真正有效的神经保护剂。因此如何促进中风后神经功能恢复，改善患者后期生活质量，依然是当前医学界研究的热点。研究表明，中医药在降低中风后致残率，促进患者神经功能恢复等方面有明显的疗效，有望为本病的脑保护治疗开辟新的途径［2］。本研究拟通过建立大脑中动脉梗死(MCAO)动物模型，从神经功能评分、脑梗死体积测定、脑源性神经营养因子(BDNF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达等方面，探究肾脑复元汤的脑保护作用和机制，并为“从肾治脑、肾脑同治”法治疗缺血性中风提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF 级Sprague Dawley (SD)大鼠，雄性，体质量为(260 ±20)g，购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SYXK (湘)2011-0003;动物合格证号43004700002454;动物饲养于湖南中医药大学SPF 级实验动物中心，许可证号SYXK (湘)2009-0001。

1.2 药物

1.2.1 药物组成 肾脑复元汤:熟地黄10 g，山茱萸10 g，山药15 g，黄芪30 g，红景天20 g，牡丹皮10 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙10 g，丹参10 g，川芎10 g。药材均购自湖南省中医药大学第一附属医院，并经药剂科鉴定为道地药材。

1.2.2 制备方法 采用自动中药煎药壶(“竹水溪”ZSXQ6 型)煎药:每剂一煎加水500 mL，煎汁200 mL;二煎加水300 mL，煎汁150 mL;2 煎混合，于水浴锅内蒸发浓缩至含生药2 g/mL，4 ℃冷藏备用。

1.3 主要仪器和试剂 石蜡切片机 (Reichert histo STAT)，光学显微镜(Olympus)，兔抗大鼠bFGF 试剂盒与兔抗大鼠BDNF 试剂盒(武汉博士德生物公司)，通用pv-9000 Kir 试剂盒(北京中杉生物公司)，甲苯胺蓝(上海试剂三厂)，伊红、苏木精、水合氯醛等其他试剂由湖南中医药大学组织与胚胎学实验室提供。

1.4 分组与给药 用随机数字表法将所有大鼠随机分为假手术组、MCAO 模型组、肾脑复元汤组，以上各组造模成功后，分为7、14、21 d 3 个亚组，每组8 只。各组于造模后24 h 开始给药，假手术组、MCAO 模型组予蒸馏水灌胃，中药组予肾脑复元汤灌胃。经过预实验，中药剂量因素对药效的影响无显著性差异，故实验中只选用临床使用中药剂量，即根据60 kg 成人每日服用145 g 生药剂量进行换算大鼠给药剂量，公式为:大鼠剂量(g) =成人每日剂量(g) ×大鼠体质量与体表面积比值/人体质量与体表面积比值［3］。各组给药体积均为20 mL/kg，中药予蒸馏水稀释至相应体积灌胃，各组每日灌胃一次，直至处死。

1.5 动物造模 采用改良Zea Longa 线栓法制作大鼠MCAO 模型［4］。2 h 后拔除线栓，造成脑梗死后再灌注。术中予股动脉插管，监测血压(Bp)，留取标本行血气分析及血糖检测，整个实验中使用恒温垫及白炽灯照射维持大鼠体温在(37.0 ±0.5)℃。再灌注后2 h 后采用Zea Longa［3］5 分制神经功能评分初步评价动物造模情况，分值在1 ～3 分者入组。剔除标准:评分低于1 分或超过3 分者;身体状态极差者(如精神状态极差，发生癫痫，重度呃逆、流涎、腹泻等);未到时间点死亡者。因大鼠死亡致样本量不足时随机替补。

1.6 神经功能缺损评价 各组大鼠在造模前24 h、造模成功后24 h、处死前采用改良大鼠神经功能缺损严重程度评分量表(m-NSS)［5］分别进行评分:从运动、感觉功能、平衡能力及生理反射对大鼠各项生理功能进行等级评分，正常记0 分，异常者根据量表及严重程度记1 ～6 分，总分为18 分，分值越高表示神经功能损害越严重。评分人员熟悉评分细则但不知晓实验目的及后续实验内容，各指标评分三次取均值纳入结果。

1.7 灌注取脑与包埋 大鼠予10% 水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉后，剪开左前胸组织，暴露心脏，以9号注射针头从心尖部穿刺入左心室，夹闭腹主动脉，剪开右心耳;灌注约100 mL 生理盐水至右心耳冲出清透液体后，更换成4%多聚甲醛灌注约300 mL 断头取脑;取脑后，置于4%多聚甲醛内固定，常规法脱水、透明、浸蜡、包埋。

1.8 HE 染色 取前囱后1.0 ～1.5 mm 区域冠状切片，厚5 μm，二甲苯和无水乙醇脱蜡，苏木精染色10 min 后自来水浸洗，1%伊红复染3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片。光镜(×400)下，各组大鼠分别选取缺血侧海马区5 个互不重叠的视野，采用IPP6.0 图像分析系统，计数坏死细胞个数(胞核固缩坏死或出现空泡样变性)，取5个相同单位面积的细胞数平均值纳入。

1.9 脑梗死体积计算 从大鼠前囱前2 mm 处，每隔2 mm做一冠状切片，厚10 μm，共选取4 个层面进行甲苯胺蓝染色。染色时，石蜡切片用二甲苯脱蜡，酒精清洗至水，1%甲苯胺蓝水溶液37 ℃染3 min，自来水漂洗，95%乙醇分化，0.5%伊红染液复染1 ～2s，二甲苯透明后封片。采用ImageJ 图像分析软件计算脑梗死面积(深紫色区域为正常脑组织，浅白色区域为梗死区)，各脑片梗死面积乘以厚度(2 mm)为梗死体积。

1.10 免疫组化 取前囱后1.0 ～1.5 mm 区域做冠状切片，厚5 μm，免疫组化染色进行BDNF 及bFGF 检测。脑片常规脱蜡、水化组织，3%过氧化氢孵育10 min，0.01 mol/L柠檬酸盐液中100 ℃修复10 min×2 次，PBS 冲洗2 min×3次，湿盒中滴加1:100 稀释一抗、37 ℃孵育2 h 后，分别滴加聚合物辅助剂和辣根酶标记二抗，37 ℃孵育30 min，DAB 显色，常规脱水、透明及封片。阴性对照滴加PBS 代替一抗。

1.11 BDNF 及bFGF 表达检测 每组每个指标检测8 张切片，分别选取缺血海马区5 个互不重叠的视野，采用IPP 6.0 软件进行图像分析，测定阳性细胞的平均光密度值，取5 个视野平均值纳入，光密度值高，则细胞阳性染色强度高。

1.12 统计学处理 采用SPSS 19.0 进行统计学分析。实验数据以(±s)表示，计量资料采用t 检验进行两组间比较，多组比较采用单因素反差分析比较，P ＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠生理指标检测 各组大鼠在脑缺血前30 min，再灌注后30 min，平均动脉血压BP、血液pH、PaO2、PaCO2和血糖均维持正常，组间差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

表1 大鼠生理指标检测(±s，n=8)

表1 大鼠生理指标检测(±s，n=8)

/mmHg 血糖/(mg·dL -1)缺血前 再灌注 缺血前 再灌注 缺血前 再灌注 缺血前 再灌注 缺血前 再灌注假手术组 76.4 ±2.3 76.8 ±2.0 7.29 ±0.02 7.27 ±0.02 31.4 ±1.5 31.8 ±2.1 108.2 ±6.6 109.0 ±6.1 92.9 ±8.2 103.5 ±10.0模型组 77.0 ±2.5 76.7 ±2.3 7.30 ±0.03 7.28 ±0.01 31.6 ±1.7 31.2 ±1.9 108.0 ±6.0 109.2 ±6.1 94.5 ±9.9 104.7 ±10.3肾脑复元汤组 76.0 ±2.5 76.5 ±2.1 7.28 ±0.04 7.29 ±0.03 31.3 ±1.6 32.0 ±2.5 108.5 ±6.5 108.9 ±5.9 93.0 ±8.0 10组别 血压/mmHg pH PaO2/mmHg PaCO2 4.0 ±10.2

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分 大鼠脑缺血后，神经功能明显下降，肾脑复元汤组在持续给药6、13、20 d 神经功能恢复明显优于模型组(P ＜0.01)，见表2。

表2 不同时间点各组神经功能缺损分值比较(±s，n=8)

表2 不同时间点各组神经功能缺损分值比较(±s，n=8)

注:与模型组相比，★P ＜0.01

组别 给药前 给药当天 给药6 d 给药13 d 给药20 d假手术组 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 0.00±0.00 9.88±1.25 8.80±1.92 7.00±2.12 5.80±2.59肾脑复元汤组 0.00±0.00 9.92±1.38 6.00±1.70★4.40±1.71★3.20±1.32

2.3 HE 染色 在光镜下对缺血区脑组织进行形态学观察，假手术组海马区细胞轮廓正常，排列紧密，胞核居中;7、14 d 时，模型组和肾脑复元汤组可见梗死区液化或者钙化病灶，胞核固缩坏死或出现空泡，细胞结构散乱、部分细胞轮廓不清，但肾脑复元汤组细胞坏死较模型组轻(P ＜0.01);21 d 时，各组细胞排列有序，轮廓清晰，模型组仍可见少量坏死细胞，明显多于肾脑复元汤组(P ＜0.01)，见图1，表3。

表3 坏死细胞计数比较(±s)

表3 坏死细胞计数比较(±s)

注:与模型组相比，★P ＜0.01

组别 例数 坏死细胞数，个/mm 2 7 d 14 d 21 d假手术组8 1.63 ±0.74 1.58 ±0.66 1.41 ±0.45模型组 8 31.16 ±7.26 20.22 ±4.70 5.51 ±1.02肾脑复元汤组 8 23.26 ±5.21★ 11.23 ±3.85★ 2.61 ±0.85★

2.4 大鼠脑梗死体积比较 随着时间的延长，各组大鼠脑梗死体积逐渐缩小，且肾脑复元汤组大鼠在各时间点脑梗死体积均较模型组小，差异有显著统计学意义 (P ＜0.01)，见表4。

图1 海马区细胞形态学观察(HE，×400)

表4 大鼠脑梗死体积比较(mm3，±s)

表4 大鼠脑梗死体积比较(mm3，±s)

注:与模型组相比，★P ＜0.01

组别 例数梗死体积7 d 14 d 21 d假手术组8 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型组 8 90.56 ±12.56 61.39 ±12.36 32.69 ±8.56肾脑复元汤组 8 71.26 ±10.25★40.65 ±9.25★ 20.05 ±6.66★

2.5 BDNF 及bFGF 表达检测 假手术组BDNF 及bFGF 平均光密度值无明显变化;随着时间延长，脑缺血损伤各组BDNF 及bFGF 平均光密度值均呈不同程度降低。肾脑复元汤组BDNF 及bFGF 光密度值在各时间点较假手术组均有显著差异(P ＜0.01)，BDNF 光密度值在7、14 d 较模型组有显著差异(P ＜0.01)，bFGF 光密度值在第7 天较模型组差异有显著统计学意义(P ＜0.01)，见表5，图2。

表5 各组大鼠BDNF 及bFGF 表达比较(±s，n=8)

表5 各组大鼠BDNF 及bFGF 表达比较(±s，n=8)

注:与模型组相比，★P ＜0.05，▲P ＜0.01

BDNF bFGF第7 天 第14 天 第21 天 第7 天 第14 天 第21 天假手术组 0.175 ±0.016 0.176 ±0.014 0.174 ±0.017 0.152 ±0.017 0.151 ±0.021 0.149 ±0.019模型组 0.195 ±0.020 0.187 ±0.018 0.176 ±0.021 0.185 ±0.023 0.170 ±0.015 0.150 ±0.022肾脑复元汤组 0.232 ±0.018▲ 0.198 ±0.016▲ 0.183 ±0.012★ 0.214 ±0.015▲ 0.190 ±0.020★ 0.171 ±0.016组别★

图2 BDNF 及bFGF 第7 天时的表达(×400)

3 讨论

缺血性中风好发于中老年人，盖因中年之后肾气渐损，精水日涸，髓海空虚，气血生成乏源，气虚则血滞，遂致脑络血液凝涩不畅，发为中风。肾为一身之根本，髓海有病，其本在肾，故治肾亦即治脑。因此肾虚血瘀也是本病重要的病机，治疗本病，在活血化瘀的同时，要补肾生髓，从肾治脑、肾脑同治，使肾精髓旺，血活瘀祛，如此则精盛、髓满、脑充、瘀散、络畅、窍通。

根据从“肾治脑、肾脑同治”理论组方的肾脑复元汤是治疗缺血性中风的有效方药，临床应用可明显改善脑卒中患者的神经功能，降低致残率，提高生活质量［6-7］。本方君以熟地、黄芪，熟地养血益阴、填补精髓，大剂量黄芪可峻补脾胃元气，气旺则血脉通，两者合用，益精生髓，血行瘀去;臣以山药、山茱萸，山药益气养阴、补脾益肾，山茱萸补益肝肾、兼能涩精，合熟地更增补养肝肾之功效，取“肝肾同源”之意;佐以大队活血通络之品，牡丹皮、赤芍清热凉血、活血祛瘀，兼制山萸肉之温涩，红景天、当归尾补血通络、活血止痛，且有化瘀而不伤血之妙;使以地龙，引药入经，通经祛瘀;全方共奏益肾补气活血通络之功。

BDNF 及bFGF 同属神经营养因子家族，在脑缺血损伤修复过程中起着重要的作用。BDNF 在大脑皮层及海马区含量较多，脑缺血再灌注损伤可以诱导其表达，从多个方面减少炎症损伤和细胞凋亡。BDNF 可促进细胞内Ca2+结合蛋白表达、稳定Ca2+浓度，抑制一氧化氮合酶的产生、减少自由基生成，下调Bax/Bcl 表达、抑制β-淀粉样蛋白介导的细胞凋亡［8］;脑缺血后，BDNF 还可以通过与其特异性trkB 受体相结合，增加神经突触可塑性，促进轴突生长，改善脑组织修复［9］。bFGF 属于FGF 家族，是一种广谱的促神经生长因子和促神经细胞分裂因子，但正常情况下脑组织内含量较少［10］。脑缺血发生后，bFGF 表达明显增加，其可以通过特异性提高caspase-3 基因、降低Bcl-2 基因的表达，促进细胞分裂、增殖和血管新生，并抑制神经元凋亡，减少再灌注损伤;另外，bFGF 还能通过结合其特异性受体，激活酪氨酸激酶，增加NO 释放，扩张局部血管，改善微循环和细胞代谢，拮抗脑组织缺血缺氧损伤［11］。

本研究结果表明，与模型组相比，肾脑复元汤可以明显改善脑缺血再灌注大鼠运动和感觉神经功能，并促进脑梗死组织修复;在神经营养因子表达方面，肾脑复元汤可以明显提高BDNF 及bFGF 的表达。因此，肾脑复元汤可能是通过促进内源性神经营养因子的表达，从而促进神经细胞增殖和血管新生，减少细胞凋亡，抑制缺血再灌注损伤，以发挥其“脑保护”作用。实验中，大鼠术前及术后各项血液生化指标(BP、pH、PaO2、PaCO2和血糖)均维持正常范围，未出现由药物引起的明显不良反应，证明了肾脑复元汤在动物实验中的安全性。因此，本实验从动物实验角度证实了肾脑复元汤治疗缺血性中风安全有效，初步揭示了其作用靶点，并为中医药“从肾治脑、肾脑同治”法治疗中风提供了实验依据。

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