藏药二十味沉香丸对暴露高原的大鼠血清及肺组织eNOS 蛋白表达的影响

李生花， 曹成珠， 杨春燕， 杨全余， 严云飞， 王建新， 靳国恩

(青海大学医学院，青海 西宁810001)

在高原，氧浓度十分低，部分人由于代偿能力差，能量代谢出现严重不足，导致细胞功能障碍，出现病理性的改变，甚至危及生命。高原性肺动脉高压(High altitude pulmonary artery hypertension，HAPH)是高原地区常见病和高发病，不同年龄段皆可发病。以肺动脉高压为主要病理特征，严重时可引起右心室结构和功能的改变。肺动脉压的维持关键在于肺血管收缩系统和舒张系统能够保持动态平衡，一旦这种平衡被打破，就会出现HAPH。NO 是目前已知的由血管内皮细胞分泌的最重要的血管舒张因子，是精氨酸在内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的作用下转化成瓜氨酸的产物。因此，eNOS具有调节血压，防止白细胞黏附引起的动脉粥样硬化和平滑肌细胞增殖的作用［1］，也有人研究［2］发现患有肺动脉高压的新生儿肺组织中存在eNOS 的高表达，这可能与围产期循环适应性反应有关。增加eNOS 高表达能够减弱ROS介导的肺动脉血管收缩反应［3］。

藏药二十味沉香丸除能减弱血管收缩力之外［4］，是否也具有促进血管舒张而发挥抗缺氧的作用，尚没有临床记载。本研究将阐明eNOS 是否参与了对高原性肺动脉高压的调控，从而起到中藏药特有的调理作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 将165 只雄性Wistar 大鼠(四川大学实验动物中心提供，许可证号SCXK［川］2009-09)由成都空运至西宁(海拔2 260 m)，随机分为平原对照组(LC，n =15)、高原对照组1、3、7、15、30 d 组(HC，15 只/组)和高原给药组1、3、7、15、30 d 组(HD，15只/组)。平原组到达西宁当日测定相关生理指标和采取形态学及分子生物标本并保存于相应的温度环境下。高原对照组和高原给药组大鼠当天从西宁直接运至海拔4 500 m(果洛州花石峡镇)地区。高原对照组用0.9%生理盐水灌胃，高原给药组用藏药二十味沉香丸制成的水剂 (0.1 g/mL)，按1 mL/100 g 灌胃。于规定日测相应生理指标并采集标本，储存于液氮保存。

1.1.2 藏药二十味沉香丸［8 g/ (d·60 kg)］，购自青海省金诃藏药集团。

1.1.3 试剂仪器 25%乌拉坦(江苏东邦医药化工有限公司)，eNOS 测定ELISA 试剂盒和NOS 免疫印迹试剂盒(产品批号分别是sc-49058、sc-49055，美国Santa Cruz 公司)。MP150 十六导生理信号采集系统 (美国BioPac 公司)，酶标仪(ELX800，美国BIO-TEK 公司)，mini protean 3 cell 电泳仪(美国BIO-RAD 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 血清学测定 从颈内静脉采集全血，3 000 r/min离心25 min 获取血清，储存于液氮。

1.2.2 肺动脉压测定 每只大鼠用25%乌拉坦麻醉(125 mg/100 g 体质量)，麻醉平稳后，分离出右侧颈外静脉，用肝素化的弯头聚次亚乙烯管(内径0.28 mm)沿颈外静脉插入，直至肺动脉，插管位置利用其典型波形进行确定，压力换能器终端连接MP150 十六导生理信号采集系统(美国BIOPAC 公司)，通过显示器观察波形变化，并用相关软件进行采集和分析。测完后立即处死大鼠，测定左右心室比值，收集血清于液氮保存。

1.2.3 形态学观察 HE 染色法对不同组大鼠肺组织进行固定、脱水、石蜡包埋、切片、染色。光镜下观察。

1.2.4 用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清NOS 的量和免疫印迹法测定肺组织中的eNOS 表达量。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS 11.5 软件包进行统计学处理，进行多组方差分析检验。P ＜0.05 为差异有显著意义。

2 结果

2.1 藏药二十味沉香丸对暴露于高海拔不同时间的大鼠肺动脉压、血清eNOS 表达水平的干预作用 见表1。

表1 三个组大鼠不同时间段PAP 和血清eNOS 水平比较(±s)(1 mmHg=0.133 kPa)

表1 三个组大鼠不同时间段PAP 和血清eNOS 水平比较(±s)(1 mmHg=0.133 kPa)

注:与平原组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与高原对照组相比，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

组别PAP/mmHg 血清eNOS/(ng·mL -1)1 d 3 d 7 d 15 d 30 d 1 d 3 d 7 d 15 d 30 d平原组(n=15)20.18 ±3.26 — — — — 13.31 ±0.85————12.65 ±1.71高原药物组(n=75)高原对照组(n=75)18.31 ±0.22 23.07 ±3.39 32.24 ±5.4＊＊30.00 ±2.81＊＊48.12 ±11.9＊＊16.25 ±3.11*20.96 ±1.51＊＊16.91 ±3.40＊＊13.65 ±1.39*20.65 ±2.80 22.14 ±2.93 25.29 ±3.02ΔΔ 23.78 ±4.8ΔΔ 27.03 ±4.27ΔΔ 17.33 ±2.44 19.39 ±0.85Δ 20.51 ±1.51Δ 19.00 ±2.66ΔΔ 16.61 ±4.22 Δ

从表1 可以看出，无论是高原对照组还是高原药物组，随在高原生活时间的延长，其肺动脉压呈现增加的趋势，与平原组相比P ＜0.01，但高原对照组增长幅度远大于高原药物组，在低氧30 d 内其增长幅度是高原药物组的4倍，显示出藏药二十味沉香丸具有较好的抗缺氧效果。

在高原对照组，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)于低氧早期就有所升高，特别在第3 天达到高峰，与平原对照组相比有显著性差异(P ＜0.01)，第7 天开始下降，于第30天下降至平原对照组水平，甚至更低。有趣的是高原药物组中eNOS 蛋白表达水平完全不同于高原对照组，与平原对照组相比，在暴露低氧30 d 的过程中，一直处于高表达水平(P ＜0.01)，特别是第7 天起，其水平均超过了高原对照组。虽然第15 天以后开始下降，但远高于平原对照组和高原对照组(P ＜0.01)。

2.2 高原对照组和高原药物组肺组织形态学特征 慢性低氧引起肺动脉高压的主要环节就是肺血管重建，即动脉血管壁增厚和肌性化。图1 显示随着暴露低氧时间的延长，肺动脉壁逐渐增厚，尤其是高原对照组增厚十分明显，并有散在出血点。虽然藏药组肺动脉壁也呈现与时间成正比的增厚趋势，但相比高原对照组，这种增厚并不明显，也不足于影响其运输血的功能。

我们对两个组不同时间肺动脉壁厚度进行了测量，见表2。肺动脉壁厚度7 d 前在高原对照组和高原药物组之间无差异，7 d 后开始出现显著差异，至30 d 后高原对照组肺动脉璧厚度是高原药物组的2 ～3 倍(P ＜0.01)。

表2 高原对照组和高原药物组大鼠肺血管壁厚度比较

图1 高原对照组和高原药物组大鼠动脉血管平滑肌层结构图(HE 染色，×200)

2.3 藏药二十味沉香丸对肺组织eNOS 蛋白表达的影响高原对照组和高原药物组中，eNOS 蛋白在肺组织中的表达是不同的，高原对照组中该蛋白表达量很高，特别是第7天、第15 天为最高，第30 天略有下降，但仍高于低氧第1天和第3 天;在高原药物组该蛋白在第1 天就开始升高，并保持在较高水平上，第15 天和第30 天开始降低，但仍高于高原对照组第1 天和第3 天，但随着时间越长，eNOS蛋白表达水平逐渐减弱。见图2。

图2 高原对照组和高原药物组肺组织eNOS 水平表达

从其灰度值(表3)可以看出，低氧明显增加eNOS 表达，特别是在高原对照组第7 天开始相当明显。高原药物组虽然低于高原对照组，但经过药物干预后，eNOS 蛋白水平一直处于较高水平。平原组eNOS 水平(537.1 ±79.4)并不高，相比低氧第1 天的eNOS 表达无明显差异。表明正常情况下，eNOS 在机体并不升高，仅仅保持一定的浓度以维持其正常生理功能，只有如低氧刺激下，其表达才会增加，以对抗一些缩血管因子的作用。

3 讨论

高原性肺动脉高压的形成机制包括血管收缩和血管重建，其中血管收缩机制涉及神经、激素和一些内皮细胞释放的因子，是肺血管收缩和舒张力量失平衡而致。单从细胞因子看，目前研究最多的具有收缩血管作用的因子有ET-1［5］，5-HT［6］，血管 紧 张 素Ⅱ［7］等，舒 张 因 子 有NO［8］、H2S、CO、腺苷等。本研究发现藏药二十位沉香丸能够显著预防低氧引起的肺动脉压过度升高的作用，其机制之一就是该药能够促进eNOS 水平的升高，后者可通过促进精氨酸转化为瓜氨酸的过程中释放NO，从而使肺血管舒张，降低血管阻力，防止肺血管压力过度升高。

在我们的研究中，发现平原大鼠移至海拔4 500 m 地区，其肺动脉压会升高，肺血管壁增厚，这种变化随在高原生活时间的延长而增加，特别是高原对照组在第7 天起改变明显，这与我们以往的研究结果一致［9-10］。本研究发现藏药二十味沉香丸可能通过促进某舒张血管的因子对抗低氧所致的血管收缩，这个因子可能就是NO，而eNOS 表达量能够间接反应NO 水平［11-12］，研究表明低氧初期eNOS水平也明显升高，低氧后期明显下降，这可能是机体代偿机制起作用，目的就是对抗急性低氧引起的缩血管作用［13-14］，eNOS 释放呈现先高后低的特征，肺动脉压是否升高或降低，除取决于血管收缩力量之外，也取决于eNOS升高程度或其蛋白降解的时间。藏药二十味沉香丸能够显著促进血清eNOS 高表达，并维持在一个较高的水平上，延缓其降低的速度，效果特别明显。说明藏药二十味沉香丸具有预防肺动脉压快速升高的作用，干预eNOS 水平是该药降低肺动脉压的机制之一。

有趣的是，eNOS 水平在血清和肺组织中的表达并不一致，无论高原对照组或药物组大鼠血清eNOS 蛋白表达与肺动脉压变化一致。但在高原对照组大鼠肺组织中eNOS并未呈现先高后低的特点，而是第7 天开始才增加，并维持在一个较高的水平，按理肺动脉压应该下降，但结果恰恰相反，原因不是很清楚，有待于进一步研究。高原药物组大鼠血清eNOS 水平在暴露高原第1 天和第3 天有所升高，并维持在一个较高的水平，第30 天显著降低，但总体看其表达量不如高原对照组，与血清该蛋白表达水平不一致。或许能够调节血管张力引起的肺动脉压的eNOS 主要存在于血清，而肺组织eNOS 或许参与了低氧后期的血管重建，从我们的研究发现，藏药二十位沉香丸对预防低氧早期引起的肺动脉高压有显著效果，但对预防低氧后期由于血管重建引起的肺动脉高压效果明显减弱，也许这与肺组织中eNOS 蛋白水平低有关。

总之，藏药二十味沉香丸具有较好的干预肺动脉高压形成的作用，但由于药物成分复杂，其作用机制也极其复杂。而低氧初期能够显著促进NOS 水平仅为其作用机制之一。

致谢:花石峡卫生院、青海大学医学院高原医学研究中心在本研究中所给予的大力支持和帮助。

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