穿心莲内酯对脓毒血症大鼠肝损伤的保护作用

杨新娟

(辽宁医学院附属第一医院感染科，辽宁 锦州121001)

脓毒血症是感染科常见的临床重症，是一种全身性的恶性炎症反应状态，病死率非常高，中国目前每年就有将近300 万脓毒血症新发病例［1］。大量的研究证实，炎症反应是脓毒血症高致死率的主要原因［2］。脓毒血症是化脓性细菌入血繁殖引起，因此其病理反应遍布全身多系统多器官，例如心肌损伤、肝损伤、肾损伤等;严重的脓毒血症可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)、多器官功能衰竭(MSOF)等，成为临床重患主要的致死原因之一。在脓毒血症所致的器官损伤中，肝损伤位列第二，基于肝脏的特殊生理功能，肝功能损伤又能够诱发或者加重其他脏器损伤或者功能衰竭。因此，对于脓毒血症所致肝损伤的治疗，除了抗生素控制感染，抑制炎症反应也是非常重要的治疗手段。穿心莲内酯是爵床科植物穿心莲的主要有效成分，目前研究证实穿心莲内酯具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤以及增强免疫等作用，对脓毒血症引起的肺损伤亦有很强的保护作用［3-5］。本研究通过盲肠结扎穿孔法复制脓毒血症大鼠模型，观察穿心莲内酯对于脓毒血症大鼠肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 穿心莲内酯为四川省玉鑫药业有限公司产品，批号130501;注射用氨苄青霉素钠购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号20120503;ALT、AST 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒为R＆D 公司产品;一抗(p65，IκBα)为Santa Cruz公司产品;其他试剂均为分析纯。

1.2 动物 健康级SD 大鼠40 只，雌雄不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK (辽)2009-0004。

1.3 仪器 全自动多功能酶标仪MK3 (芬兰雷勃公司);化学凝胶成像系统、垂直电泳系统(国美伯乐公司);电子天平(梅特勒公司);冷冻离心机(美国Sigma 公司);切片机、烤片机(德国Leica 公司);半干转印仪(美国伯乐公司)。

2 试验方法

2.1 模型制备 采用盲肠结扎穿孔法［6］复制脓毒症大鼠模型。术前12 h 禁食，将大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉，仰卧位固定于动物实验台上，于腹部正中位置切1.0 cm 左右的切口，用无损伤探子，暴露出该段盲肠，轻轻牵拉出盲肠，放于消毒过的纱布上。0 ～3 号无菌缝合线结扎距盲肠末端约1.5 cm 处，20 G 无菌针头于盲肠肠系膜血管对侧乏血管区域结扎盲肠，不穿透盲肠。之后用手轻轻挤出肠内容物，大小约为米粒大，保证穿刺孔的通畅，最后将暴露的肠管和肠内容全部纳入到腹腔，用0 ～4 号手术缝合线逐层关闭腹壁切口。手术后，实验组大鼠用1 mL 生理盐水皮下注射补充血容量。

2.2 分组及给药 纳入本研究的大鼠随机分成4 组:①正常组;②模型组;③抗生素组 (氨苄青霉素钠组200 mg/kg);④氨苄青霉素钠(200 mg/kg) +穿心莲内酯组(50 mg/kg)。自手术后12 h 开始给药，穿心莲内酯的给药方式为灌胃，氨苄青霉素钠的给药方式为皮下注射，每次给药间隔12 h，连续给药6 次。

2.3 肝脏的病理变化 给药结束后，取肝组织于4%的多聚甲醛中固定过夜，梯度酒精脱水，二甲苯两次，每次15min，浸蜡。切片，捞片，烤片。再次脱蜡，脱苯，苏木精-伊红染色，普通光学显微镜观察肝脏组织病理改变。

2.4 血清AST、ALT、TNF-α、IL-6 测定 给药结束后，大鼠眼眶取血，离心，取上层血清，按试剂盒要求操作，测定AST、ALT、TNF-α、IL-6。

2.5 Western 印迹法测定p65，IκBα 表达水平 末次给药后6 h，取血，然后取肝组织提取核蛋白，称量，裂解液裂解，超声，BCA 法蛋白定量，制成1 μg/μL 蛋白样品，冰箱冻存。电泳时每组取10 μL 样品，110 V 电压进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察Maker 的移动情况，适时终止电泳。结束后将膜取出放到转膜液中漂洗30 min，转膜、封闭、洗膜，然后分别与其特定的一抗杂交液室温反应2 h。再与二抗反应至少1 h，再次洗膜3 次，加ECL 显色，上机检测。

3 结果

3.1 ALT、AST 活性测定 如表1 所示，模型组大鼠AST、ALT 显著增高，抗生素治疗可部分降低AST、ALT 水平，而在加用穿心莲内酯的基础上，AST、ALT 水平进一步降低。

表1 穿心莲内酯对大鼠血清ALT、AST 活性的影响(n=8)

3.2 肝脏HE 染色所见的病理变化 如图1 所示，正常组的肝脏未见任何病理变化，模型组肝组织排列紊乱，可见严重的炎症反应，肝小叶出现水肿。抗生素组肝脏的变化轻于模型组，而在抗生素的基础上联合穿心莲内酯对肝脏的改善作用更明显。

图1 肝组织HE 染色

3.3 各组存活大鼠TNF-α、IL-6 变化 如表2 所示，与模型组相比，抗生素治疗可部分降低血清中TNF-α、IL-6 水平。抗生素联用穿心莲内酯后TNF-α、IL-6 水平进一步降低。

表2 穿心莲内酯对大鼠血清TNF-α、IL-6 的影响(n=8)

3.4 穿心莲内酯对p65、IκBα 表达水平的影响 如图2 所示，模型组大鼠组织中p65 表达增高而IκBα 表达降低，提示模型组中存在NF-κB 通路的激活。抗生素的应用可部分抑制NF-κB 通路，而抗生素联合穿心莲内酯可进一步下调NF-κB 通路。提示穿心莲内酯能够抑制NF-κB 信号通路。

图2 大鼠肝组织中p65，IκBα 表达

4 讨论

脓毒血症是一种以感染为病理基础、以炎症反应为基本病理变化的临床综合症，会引起全身多系统、多器官病变，甚至发展成为多器官功能衰竭。肝损伤在脓毒血症继发的所有脏器损伤中位列第二，并且肝细胞功能丧失可能诱导多器官功能衰竭，因此对于脓毒血症的治疗，抗感染的同时减轻肝损伤至关重要。目前以抗生素控制感染的临床治疗方法效果并不理想，死亡率仍然很高，死亡率居高不下的原因可能和炎症反应得不到有效控制有关。特别是革兰氏阴性细菌引起的脓毒血症，细菌被抗生素杀死细后，细胞壁内脂多糖会大量释放入血。脂多糖为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分，其主要通过Toll 样受体TLR4 介导炎症反应。当TLR4 与受体结合后就被活化，然后会活化核因子κB (NF-κB)，NF-κB 大多数是以p50/p65 亚基形成的二聚体的形式存在于体内［7］。NF-κB 没有被活化时，与IκBα 结合存在于细胞内，是无活性的复合体。当NF-κB 被活化以后，IκBα 被磷酸化后发生降解，NF-κB 被释放入核，p65 亚基与DNA 的特定位点结合，诱导单核/巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6 等，后者引起严重的炎症反应。

穿心莲是爵床科植物，传统中医理论认为它具有清热解毒、凉血消肿等功效。穿心莲内酯为穿心莲中提取得到的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一，已有研究表明，穿心莲内酯可以通过抗炎抗氧化抑制肝细胞损伤［8-9］。本研究结果表明，穿心莲内酯辅助抗生素治疗脓毒血症大鼠能够显著降低肝脏的炎症反应，降低血清TNF-α、IL-6 水平，降低血清ALT、AST 水平，并且能够显著减轻肝脏的病理变化。本研究进一步证实，穿心莲内酯联合抗生素治疗与单用抗生素治疗相比，p65 表达水平进一步降低，IκBα 的表达水平进一步增高，此结果提示，穿心莲内酯可能是通过下调NF-κB 炎症通路，降低炎性因子包括TNF-α、IL-6 表达水平，进而降低肝脏的炎症损害。

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