响应面法优化超声提取中药茜草中多糖工艺

张海容， 刘 娟， 魏增云， 陈金娥

(1. 山西省忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000;2. 山西省忻州职业技术学院，山西忻州034000)

茜草Radix Rubiae 是常用的传统中药，又名活血草、地血、锯子草、血见愁等，其性寒、味苦、归心肝经，具有凉血止血、活血祛瘀、祛风除湿、祛瘀通经、止咳祛痰的功效，古时除作药用外，还用作染料，其有效成分有茜草素、蒽酮、肽类、萘醌及其苷类化合物、萜类、多糖类等［1-2］。现代药理研究表明［3-4］，茜草多糖除了能作为储能物质和结构支持物质外，还具有护肝、止血、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抑制人表皮细胞增殖、调节机体免疫功能，防御细菌或病毒感染等生物活性，因此快速高效提取茜草多糖，对中药活性成分研究与开发具有重要的应用价值。

超声提取是应用超声波强化提取的方法，对媒质主要产生独特的机械振动和空化作用［5-6］，具有选择性高、提取时间短以及不需要特殊的分离步骤等优点。本实验将用超声—响应面法提取茜草多糖，该方法具有试验次数少、精度高、适用于多因素和多水平试验等优势，在食品、化学和生物优化过程中被广泛使用［7-9］，可为工业化生产药物多糖提供理论参考和实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器和材料 AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);723 可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);KQ-400KDE 高功率数控超声波清洗器(400 W，昆山市超声仪器有限公司)。

茜草(产地河北，忻州市鹿林大药房);葡萄糖为分析纯(北京化学试剂公司);苯酚为分析纯(天津市风船化学试剂科技有限公司);浓硫酸(天津市耀华化学试剂有限责任有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 移液管精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 葡萄糖标准溶液(100 μg/mL)，置于9 支比色管中，用二次蒸馏水补充至2 mL，然后加入5%苯酚溶液1 mL 和98%浓硫酸5 mL，静止0.5 h，冷却至室温后，在最大吸收波长490 nm 处，以空白试剂为参比，测定吸光度值。然后，以吸光度值为纵坐标(A)，质量浓度(μg/mL)为横坐标(C)绘制工作曲线，得到回归方程A=0.053 2C-0.010 5，R2=0.999 5。

1.2.2 茜草多糖的测定 将茜草粉碎并过筛后，准确称取0.200 g，置于锥形瓶中，加入一定体积的二次蒸馏水，在选定的不同超声条件下提取茜草多糖。然后，趁热抽滤，收集滤液，将其稀释5 倍，进行吸光度检测。

苯酚-硫酸法［10］是测定多糖含有量的常用方法。准确吸取稀释后的滤液2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL 和98%浓硫酸5 mL，以不加苯酚和浓硫酸的样品溶液为参比，静置0.5 h，冷却至室温后，在最大吸收波长490 nm 处测定吸光度，计算茜草多糖的产率，计算公式如下。

1.2.3 单因素试验 影响超声提取茜草多糖的因素很多，本实验选取超声功率、温度、时间、料液比及提取次数为因素，考察其对茜草多糖提取工艺的影响。

1.2.4 响应面法优化设计 在单因素试验结果的基础上，多糖产率在超声功率240 W、液料比40 mL/g、温度55 ℃、时间6 min、提取2 次时最高，本实验中，选取功率(A)、温度(B)、液料比(C)、时间(D)这四个因素进行中心组合设计［11-13］，利用响应面分析法优化茜草多糖提取工艺的条件，见表1。

表1 Box-Benhnken 中心组合试验设计和水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果(图1)

2.1.1 超声提取功率对茜草多糖产率的影响 其他因素不变，在160、240、320、400 W 下进行超声提取，结果见图1A。从图可知，随着超声功率增加，茜草多糖的产率逐渐提高，但在功率240 ～320 W 处，产率上升幅度不明显，考虑到节省能源及超声仪器功率限制，故选取240 W 为最佳功率。

2.1.2 液料比对茜草多糖产率的影响 其他因素不变，按液料比20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1 进行实验，结果见图1B。从图可知，液料比的增加对茜草多糖产率的影响较大。在液料比约为40 ∶1 时，产率达到最大，但大于40 ∶1 时，产率反而下降。因此，从经济节约角度考虑，选择液料比40 ∶1 左右为宜。

2.1.3 温度对茜草多糖产率的影响 其他因素不变，在35、45、55、65、75 ℃温度下进行提取，结果见图1C。从图可知，随着温度的升高，茜草多糖的产率逐渐提高，但达到55 ℃后，产率基本无太大增加，可能是由于温度过高而导致多糖降解，故选取55 ℃为最佳提取温度。

2.1.4 时间对茜草多糖产率的影响 其他因素不变，在2、4、6、8、10 min 进行提取，结果见图1D。从图可知，随着时间的增加，茜草多糖的产率逐渐提高，而在6 min时产率最高。因此，最佳的超声时间为6 min。

图1 不同因素对茜草多糖产率的影响

2.1.5 提取次数对茜草多糖产率的影响 准确称取样品0.2 g，在上述条件下提取一次，进行吸光度检测。然后，收集所得残渣，在相同条件下进行第二和第三次提取，并计算多糖产率，通过比较来确定最佳提取次数，结果见图2。由图可知，为了节省能源的消耗，选择提取次数为2 次。

2.2 响应面分析法优化茜草多糖实验 利用Design-Expert软件进行实验设计，得到响应面分析结果及其预测值，结果见表2。

图2 提取次数对茜草多糖产率的影响

表2 响应面法分析实验方案与结果

利用Design-Expert 软件，对实验数据进行多项拟合回归，得到回归方程P =8.73 +0.018A +0.13B -0.053C +0.010D - 0.10AB - 0.077AC - 0.13AD - 0.033BC -0.045BD-0.045CD -0.38A2-0.47B2-0.60C2- 0.51D2，对其进行方差分析，结果见表3。由表可知，本实验所选模型的P ＜0.000 1，说明回归方程在描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系极显著，表明该方法非常可靠。另外，在所选因素水平范围内，对结果影响的排序为温度＞料液比＞功率＞时间，而且变异系数较低(CV 为2.47%)，说明该方法具有良好的稳定性。同时，模型的相关系数R2=0.895 2，说明模型可靠性较好，89.52%的实验数据也与模型一致。除此之外，失拟项＞0.05，不显著，说明该模型与实际试验拟合较好，可用于茜草多糖提取的分析与预测。

2.3 响应面图分析 由回归方程绘制出响应面分析图，该图直观反映了各因子的交互作用，当提取时间为6 min 时，提取温度55 ℃与功率240 W 对多糖提取产量的交互作用显著;温度55 ～60 ℃、液料比40 mL/g 时，提取温度与水体积对多糖提取产量的交互作用显著，而且对其浓度改变较大;提取功率和液料比接近零时，多糖的提取浓度最高，可见两因素交互作用非常明显，而且茜草多糖产率的最高点出现在各因素的零水平附近处。由此，在交互项对提取率的影响中，可看出超声时间和功率、温度和功率、液料比和温度的影响较为显著，与方差分析基本一致，见图3。

表3 模型的方差分析

3 验证性实验

对回归方程P = 8.73 + 0.018A + 0.13B - 0.053C +0.010D - 0.10AB - 0.077AC - 0.13AD - 0.033BC -0.045BD-0.045CD -0.38A2-0.47B2-0.60C2-0.51D2取一阶偏导，得到四个四元一次方程组0.018 - 0.1B -0.077C- 0.13D - 0.76A = 0、0.13 - 0.1A - 0.033C -0.045D-0.94B =0、0.053 +0.077A +0.033B +0.045D +1.2C=0、0.01 -0.13A -0.045B -0.045C -1.02D =0。然后对其求解，计算出A = 0.016 845、B = 0.132 17、C =0.041 03、D=0.000 131，最后求得最佳超声功率(A)为241.3 W，最佳温度(B)为56.3 ℃，最佳液料比(C)为40.4 ∶1，最佳提取时间(D)为6 min，该条件下茜草多糖的最大理论产率为8.73%。由于实验条件限制，修正后的各实际影响因素分别为功率240 W、温度56 ℃、液料比40 ∶1、提取时间6 min。在此条件下，茜草多糖的产率为8.75%，与理论值8.73%接近，证明该模型的准确性、可靠性及重要的使用价值。

4 超声提取与常规热水法对比实验 精密称取茜草粉末10.0 g，置于500 mL 锥形瓶中，以液料比40 ∶1，在80℃恒温水浴锅中加热8 h，检测其浓度，结果见表4。由表可知，超声提取法不仅耗能少(提取温度低)，而且所需时间缩短80 倍，产率也高于常规热水法，说明该提取工艺具有节能高效［14］的优越性。

图3 不同因素对茜草多糖产率的的相互作用响应面图

表4 超声波提取法与常规热水法提取茜草多糖的对比实验

5 讨论

(1)通过单因素试验，得到超声提取茜草多糖的最佳工艺条件为超声功率240 W，超声温度55 ℃，液料比40 ∶1，超声时间6 min，提取2 次。

(2)在单因素试验的基础上，选择超声功率、超声温度、料液比、提取时间这四个因素进行中心组合，用Design-Expert 软件进行数据拟合，建立了超声提取茜草多糖的工艺数学模型P = 8.73 + 0.018A + 0.13B - 0.053C +0.010D- 0.10AB - 0.077AC - 0.13AD - 0.033BC -0.045BD-0.045CD -0.38A2-0.47B2-0.60C2- 0.51D2，回归分析表明，该模型稳定性较好。通过模型系数显著性检验发现，因素的主效应关系为温度＞料液比＞功率＞时间，相关系数R2= 0.895 2，说明模型的可靠性较好，89.52%的实验数据也与模型一致。

(3)利用由响应面法得到的模型进行探讨，得到茜草多糖优化的超声提取工艺条件为超声功率240 W，超声温度56 ℃，液料比40 ∶1，超声时间6 min，提取2 次，茜草多糖的理论产率可达到8.73%，而实验值为8.75%，与理论值相符。因此，结合响应面法的茜草多糖超声提取工艺数据准确，科学可行，对工业上提取、利用、开发茜草多糖有一定的指导价值。

(4)超声提取与常规溶剂提取法的对比实验结果表明，采用前一方法提取的茜草多糖，其提取率显著优于后者。

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