钙敏感受体在大鼠扩张型心肌病心肌损伤中的作用

李智敏 刘淑华

(黑龙江省哈尔滨市第四医院老年病科 150026)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是以心脏扩大，心肌收缩功能障碍为主要特征的原因不明性心肌疾病。目前发病机制尚不清楚，有文献报道细胞凋亡在扩张型心肌病的发生中起着重要作用，且与死亡率呈密切相关［1］。细胞凋亡三个主要的信号转导通路:(1)线粒体通路;(2)死亡受体通路;(3)内质网通路，这些都与钙密切相关。据报道心肌细胞内钙超载见于多种心脏病理状态，如扩张型心肌病［2.3.4.5］。

钙敏感受体(calcium－sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦联受体的C家族成员。CaSR主要存在参与钙稳态调节的组织器官如甲状旁腺、肾脏、骨组织、胃肠道，在心血管系统［6］也有表达。已经证实，在心血管系统Ca2+通过CaSR发挥第一信使作用［7］。CaSR激活通过G蛋白－PLC－IP3通路引起细胞内钙增加，参与心肌钙稳态调控，而心肌细胞钙稳态对心肌功能至关重要［8］。尽管国内外学者对CaSR在心血管领域的作用进行了一些研究，但CaSR在DOX诱导的DCM中的表达情况未见报道。本研究拟通过对DOX诱导的大鼠DCM形成过程中心脏功能、超微结构变化以及CaSR的表达的检测，探讨DOX诱导的大鼠DCM发生的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠40只，体重220g±20g。

1.1.2 主要试剂 Western及IP细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、DOX(Pfizer Italia S.r.l.)、分离胶浓缩液、浓缩胶浓缩液、电泳缓冲液、转移缓冲液、Anti－CaSR(Alpha Diagnostic International，USA)、Anti－ GAPDH(Santa)、羊抗兔IgG－FITC、马抗鼠IgG－FITC等。

1.1.3 主要仪器 高速低温离心机(LD5－2型);电泳仪;光学显微镜，GE Vivid7彩色多普勒超声仪;酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 扩张型心肌病模型的建立 本实验参照腹腔注射阿霉素的实验方法，建立扩张型心肌病模型［9］。雄性健康Wistar大鼠40只，随机分为对照组(n=10)和模型组(n=30)，模型组随机分为3周组、6周组和9周组。模型组每周根据体重腹腔注射 DOX(2.5mg kg－1.week－1)，由生理盐水溶解并稀释，浓度为0.5mg/ml。3周组连续注射3周，每周1次，6周组连续注射6周，每周1次，9周组连续注射6周，观察3周。每周根据体重调整阿霉素剂量。应用GE Vivid7彩色多普勒超声仪对正常对照组和模型组分别于实验前和第3、6、9周末检测大鼠左室舒张期末径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收缩期末径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)和左室射血分数(left ventricular eject ion fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(fraction shortening，FS)，一般采取3个心动周期测量的数据。

1.2.2 心肌组织学观察 处死大鼠，将左心室前壁取下1mm3心肌用于组织病理切片。经10%甲醛固定，组织脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，用于苏木素－伊红(HE)染色，光学显微镜下观察心肌细胞的形态学变化。

1.2.3 免疫组化检测心肌CaSR表达情况 心肌组织4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切厚片，然后按免疫组化盒进行操作。微波抗原修复，高火3min，中火5min。一抗浓度为(1:200)，PBS稀释。细胞内成团深黄色颗粒示高表达，淡黄色颗粒示低表达，封片光镜下观察并分析平均光密度值(IOD/Area)。

1.2.4 Western Blot检测心肌CaSR表达 取心肌组织低温研磨后加蛋白裂解液及 PMSF，4℃静置50min，4℃12000r/min离心后取上清进行蛋白定量;取60μg蛋白，10%SDS－PAGE凝胶电泳2h，300mA 1.5h转至硝酸纤维素膜，脱脂牛奶封闭膜1h;一抗(anti－CaSR(1:500)，anti－GAPDH(1:2000))4℃过夜;TBST充分洗膜后，二抗(碱性磷酸酶标记的抗IgG抗体(1:1000))孵育，显色液(Promega)显色扫描，分析光密度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件，差异性检验采用完全随机设计的方差分析方法，P＜0.05表示差异具有统计学意义，P＜0.01表示具有显著差异。

2 结果

2.1 大鼠左心室功能指标的变化 与对照组相比，6周组、9周组大鼠左室收缩末期内径(LVESD)明显升高、左室射血分数(EF)明显降低(P＜0.01)，见下表。

表1 大鼠左室功能变化

2.2 心肌组织HE染色观察结果 HE染色显示正常对照组心肌细胞形态正常、胞浆纹理清晰，结构完整，无心肌纤维断裂;3周组心肌细胞胞浆疏松，少量心肌纤维增粗;6周组心肌细胞排列紊乱，部分心肌纤维增粗;9周组大部分心肌细胞肿胀，间隙增宽，心肌纤维局限性断裂。

2.3 心肌CaSR表达情况 CaSR免疫组化显示6周组和9周组明显低于正常对照组(P＜0.01)，3周组对照组比无显著差异。

Western Blot检测显示CaSR的表达逐渐降低，6周组和9周组明显低于对照组(P＜0.01)，3周组与对照组比无显著差异。

3 讨论

3.1 扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是以左心室扩大或左右双心室扩大并伴有心室肥厚、心室收缩功能障碍的心肌疾病。DCM的病因不明，其发生机制十分复杂，可能与多种因素有关，如家族性/遗传性、病毒性和(或)免疫性、代谢性以及酒精性/中毒性等［10］。实验采用腹腔注射阿霉素的方法复制扩张型心肌病模型，结果9周模型组的LVEDD、LVESD、EF、FS指标均明显低于对照组(P＜0.01);心肌组织HE染色观察结果示心肌超微结构改变严重说明成功构建了大鼠扩张型心肌病模型。

本实验检测了DOX诱导DCM大鼠3周、6周、9周时心肌CaSR蛋白的表达情况，结果发现6周组、9周组与对照组相比CaSR表达明显降低(P＜0.01)，3周组与对照组相比无显著差异。CaSR表达降低同时左室收缩末期内径(LVESD)明显升高、左室射血分数(EF)明显降低(P＜0.01)，它提示CaSR表达降低与心功能相关，可能参与了DCM的发生。

3.2 阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，其引起心肌毒性的机制不十分明确，可能与自由基作用导致心肌损伤［11］，细胞内钙超载［12］，抑制心肌相关核酸、蛋白合成［13］，氧化应激及细胞内钙超载致线粒体损伤、心肌细胞凋亡［14］有关。已经有文献报道阿霉素的心肌毒性与其引起的氧自由基损伤和肌质网摄Ca2+功能障碍有关［15.16］。心血管领域CaSR的研究开展较晚。2006年，Tfelt－Hansen等人报告，CaSR在新生大鼠心室肌细胞也有功能性表达［17］。已经证实，在心血管系统Ca2+通过CaSR发挥第一信使作用［7］。细胞外Ca2+增加及其它CaSR激动剂(Gd3等)可通过G蛋白－PLC－IP3信号转导途径引起肌浆网Ca2+释放增加，浓度增加使心脏收缩，CaSR表达降低，引起肌浆网Ca2+胞浆减少，心肌兴奋－收缩偶联障碍，心肌收缩功能降低。

本实验通过DOX诱导的大鼠DCM，检测不同时间CaSR表达变化，提示在DOX诱导的大鼠DCM过程中，CaSR表达变化可能是钙稳态紊乱的机制，这对DCM的发病机制的研究有一定的意义。

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