大黄多糖对大鼠动脉硬化形成中Toll样受体4表达的影响

梁景岩 王小洪 王英歌

(江苏省扬州大学医学院 225001)

动脉粥样硬化［1］是一种由于动脉壁慢性炎症所引起的脑血管疾病，近年来，呈逐年上升趋势。该病具有较高的发病率及致死率，给患者带来了很大的痛苦。研究发现［2］，动脉粥样硬化的发病与多种感染因素有关。专家报道［3］，Toll样受体4是可能是引起动脉粥样硬化的桥梁因素。大黄多糖是中药大黄的水溶性成分之一，研究表明，其在抗动脉粥样硬化方面作用显著。基于此，笔者拟观察大黄多糖对大鼠动脉粥样硬化形成的干预作用，并从受体角度探讨其对Toll样受体4表达的影响，为临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 大鼠，SD，雄性，体重280～300g;由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供，生产许可证号:SCXK(鲁)20130001。

1.2 药物和试剂 大黄多糖(西安天园生物制剂厂提供，批号Z20140426)，维生素D3颗粒(上海通用药业股份有限公司提供，批号H31021404)，甲醛溶液(烟台三和化学试剂有限公司提供，批号H20140423)，水合氯醛(天津市科密欧化学试剂开发中心提供，批号H20141028)，无水乙醇(杭州永星五交化有限公司提供，分析纯，批号H20141121)，苏丹Ⅲ(上海酶联生物科技有限公司提供，批号H20140824)，二甲苯(淄博丰仓化工有限公司提供，批号H20141121)，苏木素(广州深达生物制品技术有限公司提供，H20130911)。高脂饲料(由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供)。

1.3 仪器 石蜡切片机(由北京科思佳公司通用仪器网提供)，KPJ-1B生物组织烤片机(由上海珂淮仪器有限公司提供)，LY-WN-HP CCD万能视频成像装置(由四川省实验室信息平台提供)，9701型PCR仪(由赛飞(中国)有限公司提供)。

1.4 方法

1.4.1 分组造模及给药 SD大鼠48只正常饲养3天后，将其随机分为4组，即为空白组、模型组、大黄多糖小、大剂量组。空白组进行常规饲养2个月，不造模。模型组大鼠灌胃给予维生素D3颗粒(0.75mg/kg)，并采用高脂饲料喂养2个月。大黄多糖小、大剂量组均灌胃给予维生素D3颗粒(0.75mg/kg)，同时分别灌服大黄多糖小、大剂量(0.01g/kg)、(0.04g/kg)，两组大鼠亦采用高脂饲料喂养2个月。上述各组均正常喂水。4周后，在模型组中随机抽样2只大鼠，解剖并取出其主动脉弓至腹主动脉处血管，作病理切片，HE染色，若在镜下可见泡沫细胞形成且有钙盐沉积，说明造模成功。2个月后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖并取出其主动脉弓至腹主动脉处的血管，并将每只大鼠的血管分为2部分，一部分用10%甲醛固定后石蜡包埋，切片，进行HE染色，光镜观察血答壁 AS病变，运用 LY-WN-HP CCD万能视频成像装置进行形态学分析，测量并计算粥样斑块面积。另一部分低温下洗净剪碎，零下80℃低温保存备用。

1.4.2 PCR检测Toll样受体4 mRNA表达 提取大鼠血管组织总RNA，其中，总RNA提取试剂盒(TRIzol法)由上海江莱生物科技有限公司提供。选β-actor为内参，引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供。其中，Toll样受体4引物包括上游引物5＇-TTTATTCAUAUCCUTTUG3＇和下游引物 5＇-AUTTUCCUTTTCTTUTTC-3＇;βactor引物包括上游引物 5＇-CCTUTATUCCTCTGUTG3＇和下游引物 5＇-TCTTTACUUATUTCAACG3＇。反应条件:50℃下反转录20 min，94℃预变性3min，94℃变性 40s，53℃退火45s，72℃延伸8min，进行35次循环。反应结束后，采用图像分析系统检测Toll样受体4的相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资2料用±S表示，采用t检验，计数资料用率表示，采用χ 检验，以P＜0.05差异显著有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄多糖对大鼠主动脉壁动脉粥样硬化形成的抑制作用 经HE染色结合半定量分析可知，模型组动脉粥样硬化斑块面积10.1%明显高于空白组且差异显著(P＜0.05)，说明造模成功。大黄多糖小、大剂量组动脉硬化面积明显低于模型组且差异显著(P＜0.05)，大黄多糖大剂量组动脉硬化面积与小剂量组相比明显减少且差异显著(P＜0.05)，说明大黄多糖可明显抑制大鼠动脉硬化的形成，并与剂量有一定关系。结果见表1。

表1 大黄多糖对大鼠主动脉壁动脉粥样硬化形成的抑制作用(%)

2.2 大黄多糖对动脉硬化大鼠主动脉壁Toll样受体4相对表达量的影响 经RCR检测结合图像分析系统结果显示，与空白组相比，模型组Toll样受体4相对表达量明显升高且差异显著(P＜0.05)，说明造模成功。与模型组相比，大黄多糖小、大剂量组Toll样受体4相对表达量明显降低且差异显著(P＜0.05)，且大黄多糖大剂量组Toll样受体4相对表达量与小剂量组相比明显减少且差异显著(P＜0.05)，说明大黄多糖可使动脉硬化大鼠主动脉壁Toll样受体4相对表达量降低。结果见表2。

表2 大黄多糖对动脉硬化大鼠主动脉壁Toll样受体4相对表达量的影响(±S)

表2 大黄多糖对动脉硬化大鼠主动脉壁Toll样受体4相对表达量的影响(±S)

注:与空白组相比，*P＜0.05;与模型组相比，＊＊P＜0.05;与小剂量组相比，▲P ＜0.05。

组别 n 剂量(g/kg) Toll样受体4相对表达量空白组12 0.21 ±0.02模型组 12 0.72 ±0.19*大黄多糖小剂量组 12 0.01 0.62 ±0.12＊＊大黄多糖大剂量组 12 0.04 0.19 ±0.10＊＊▲

3 讨论

动脉粥样硬化是一种常见的脑血管疾病，其发病机制与多种因素有关。目前，“损伤反应学说”［4］逐渐被临床认可，该学说认为慢性炎症和血脂代谢紊乱是动脉粥样硬化的2个主要特点。近年来，有研究证实［5］，慢性炎症反应与心血管疾病关系密切。Toll样受体4［6］是发现最早的Toll样受体亚型之一，该物质能够直接介导机体与病原体之间的反应，是引起炎症反应的关键分子。有专家指出［7］，动脉粥样硬化本身就是一种炎性疾病。有研究显示［8］，在动脉粥样硬化斑中，Toll样受体4的表达明显升高，并证实导致动脉粥样硬化的细胞因子的合成与释放与Toll样受体4的识别功能有关。大黄多糖是中药大黄的有效成分之一，可通过抑制血管平滑肌细胞的增殖达到抗动脉粥样硬化的作用，实验证实［9］，大黄多糖可抑制血小板聚集，抑制细胞钙离子内流，改善血液流变学特性。另有研究表明［10］，大黄多糖一定的抗炎作用。本研究结果显示，经HE染色结合半定量分析可知，模型组动脉粥样硬化斑块面积明显高于空白组且差异显著(P＜0.05)，说明造模成功。大黄多糖小、大剂量组动脉硬化面积明显低于模型组且差异显著(P＜0.05)，大黄多糖大剂量组动脉硬化面积与小剂量组相比明显减少且差异显著(P＜0.05)，说明大黄多糖可明显抑制大鼠动脉硬化的形成，并与剂量有一定关系。经RCR检测结合图像分析系统结果显示，与空白组相比，模型组Toll样受体4相对表达量明显升高且差异显著(P＜0.05)，说明造模成功。与模型组相比，大黄多糖小、大剂量组Toll样受体4相对表达量明显降低且差异显著(P＜0.05)，且大黄多糖大剂量组Toll样受体4相对表达量与小剂量组相比明显减少且差异显著(P＜0.05)，说明大黄多糖可使动脉硬化大鼠主动脉壁Toll样受体4相对表达量降低。

综上述，大黄多糖具有抗动脉硬化作用，且其抗动脉硬化的作用机制可能与抑制动脉壁Toll样受体4的表达有关。但是，由于样本量有限，更深入的研究尚需后续研究进一步证实。

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