骨髓间充质干细胞及其在组织工程中的研究进展

【摘 要】目前，对于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离、培养，应用广泛的方法主要是全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心培养法.向骨髓液中加入红细胞裂解液后用全骨髓贴壁培养法，把红细胞裂解掉，提高了分离纯化BMSCs的效率.BMSCs的鉴定主要通过BMSCs表面抗原，但是，到目前为止，还没有发现BMSCs的具有特异性的表面抗原标志.骨髓间充质干细胞在组织工程中的研究越来越成为目前研究的热点.

【文献标识码】A

文章编号：20956894（2015）0412804

收稿日期：20150308；

接受日期：20150325

基金项目：内蒙古医科大学科技百万工程（YKD2012KJBW003）

作者简介：鲁先闯.硕士在读.研究方向：关节外科.Email：295739184 ＠qq.com

通讯作者：黄 健.Email：huangjian07316＠126.com

Bone marrow mesenchymal stem cells and research progress of them in tissue engineering

LU XianChuang 1，HUANG Jian 21Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010059，China； 2Second Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010030，China

【Abstract】At present，the widely used methods for separation and culture of BMSCs are the whole bone marrow adherent culture method and density gradient centrifugation culture method.Whole bone marrow adherent culture method，with pyrolysis liquid of red blood cells added in bone marrow liquid，could crack red blood cells and thus improve the purification efficiency of BMSCs.BMSCs are indentified mainly by their surface antigens.However，no specific surface antigen marker has been found in BMSCs so far.Bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering are becoming the hot spot of current researches.

【Keywords】bone marrow mesenchymal stem cells；tissue engineering

0　引言

关节软骨是覆盖在关节表面可保护关节表面的弹性组织.根据流行病学调查显示，国内40岁以上人群中，关节软骨面二度以上磨损大约为五分之一，而60岁以上人群中，关节软骨面二度以上磨损可达一半以上.正常的关节在关节软骨的保护下，使人们能够正常走路、爬楼梯、参加体育锻炼、爬山、弯腰蹲起等，膝关节无疼痛感.关节软骨起到保护垫的作用.病灶的软骨或软骨损伤令人痛苦甚至致人残疾，这是因为软骨缺损的修复潜力内在不足 ［1］.如同代谢失衡一样，关节软骨形成的整个活动，通过肥大和凋亡开始于细胞增殖，被确定为骨性关节炎（OA）进展的一个重要的决定因素 ［2－3］.修复软骨损伤的膝关节一直具有挑战性，大面积软骨损伤仍难以修复.软骨的损伤涉及到关节软骨和潜在的软骨下骨，关节软骨或透明软骨自身修复能力有限.因而，软骨损伤治疗的目标是恢复透明软骨和软骨下骨的再生 ［4］.

1　研究背景

20世纪90年代，WHO曾将OA与心脑血管疾病及恶性肿瘤列为威胁中老年人健康的三大杀手.对于软骨缺损，国内外有很多研究和探索，但目前尚未攻克这一难题.

1.1 症状性治疗

1.1.1 关节镜清洗和清理术 该技术可以将游离体清洗出关节腔外；同时，也可治疗由于外伤引起的关节软骨破损，例如半月板的损伤、交叉韧带的撕裂.虽然关节镜清洗和清理术能够暂时缓解疼痛，但是它治标不治本，没有解决根本问题，而且疼痛易复发.

1.1.2 胫骨高位截骨术 虽然胫骨高位截骨术能够使患者功能得到改善、使患者的关节疼痛得到缓解，但是它没有达到根本治疗关节软骨磨损的目的.为了分析治疗效果，把培养的BMSCs注射到关节内并结合微骨折术和内侧开放楔形开口的胫骨高位截骨术.把培养的BMSCs注射到关节内，较单纯胫骨高位截骨术、微骨折术，有效的提高了患者内翻膝软骨缺损的短期临床效果和磁共振观察软骨组织（MOCART）的结果 ［5］.

1.1.3 人工关节置换术 人工关节置换术创伤较大，给患者带来了巨大的痛苦和经济负担，而且可能出现后遗症，例如感染，假体松动等.

1.1.4 药物治疗 止疼药物治疗，例如西乐葆、吲哚美辛栓、ADSCs等，通过Koh等 ［6－8］的三项研究，他们用高浓度的ADSCs注射到髌骨下的脂肪垫中来治疗膝OA.首先，他们在25个患者中做了一个病例对照研究，每名患者都接受了注射单一的ADSCs，随后，继续接受富血小板血浆治疗，临床结果令人满意.在另一项研究中，与两组病例研究（不是对照）类似的治疗过程中，对于不同来源的患者使用ADSCs.所有的临床结果和软骨的MRI评分都显著提高 ［7－8］.但是止疼药物不能从根本上改变关节软骨的缺损，而且止疼药物也会带来毒副作用；延缓关节软骨退化的药物，例如维固力，但是它只能延缓关节软骨退化，而不能修复关节软骨，它只能作为中老年人的一种保健药.

1.2 骨软骨移植

1.2.1 自体移植 该方法供体来源有限，不能用于大范围缺损修复，并且不能根据缺损区很好的塑型，存在缺损区无法满意整合而造成关节退变等缺点.

1.2.2 异体移植 该方法不仅会产生排斥反应、免疫反应而且会传播疾病.

1.3 采用源于骨髓的干细胞或者纤维母细胞治疗但是修复缺损的组织不是透明软骨而是纤维软骨，纤维软骨在生物学强度等功能方面均比透明软骨差，不能达到关节软骨功能，仅能暂时缓解症状，后期出现骨性关节炎的可能性很大.

1.4 诱导软骨细胞再生

1.4.1 骨膜移植 骨膜移植不仅产生的透明软骨量少，而且再生软骨性能差.

1.4.2 软骨膜移植 软骨膜移植会出现X型胶原而II型胶原较少.

1.4.3 自体软骨细胞移植 软骨细胞增殖能力有限，几次传代培养后，软骨细胞逐渐去分化，不能继续增殖.

1.5 外周干细胞 Saw等 ［9］做了包括50名患者的队列研究，但使用的是外周干细胞.其研究结果很好，组织学评分和MRI上软骨缺损修复的结果很好，但效果还需进一步验证.

1.6 组织工程 组织工程给软骨缺损带来了希望.组织工程就是利用BMSCs在生物支架的作用下，加入细胞因子，从而使BMSCs向软骨细胞分化，来修复缺损的软骨.

2　BMSCs分离、培养的方法

BMSCs因其可塑性粘附能力、类似成纤维细胞的外表、表达特定的表面蛋白标记物而得名，并因其多向分化的能力而被明确定义.在以前的研究中已经广泛应用了兔子的骨髓间充质干细胞BMSCs （rBMSCs），经典的例子是20世纪80年代Frieden stein等 ［10］在研究大鼠骨髓成骨髓细胞时，首次从骨髓基质中分离、鉴定出一种非造血系成体多能干细胞，并在体外把这种细胞诱导分化为各种细胞，例如诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和肌肉细胞等，并把这种细胞称之为BMSCs.体外BMSCs的提取和增殖的结果显示，有两个病人较其他人BMSCs的扩增速率低，这是由于人与人之间存在个体差异性 ［11］.由于在骨髓中BMSCs含量非常少，占单个核细胞的不到十万分之一.然而组织工程需要的种子细胞的数量很大，从哺乳动物的骨髓中分离BMSCs存在缺点，使很多有关组织工程的实验难以进行.由于骨髓中BMSCs的量非常少，而且随着年龄的增长，BMSCs的数量逐渐减少 ［12］；并且，生理状态下20%为静止期细胞 ［13］.所以，找到一种体外培养BMSCs并大量扩增的培养条件，为下一步研究BMSCs生物学特性及功能和诱导分化为软骨细胞至关重要.因此，在体外获得纯度高、活力好、生物特性均一的BMSCs，对组织工程方面的研究及细胞的体内、外实验研究显得极其关键.骨髓中不仅含有大量的造血干细胞，还含有一定量的BMSCs.就像多能造血干细胞具备强大的造血功能一样，BMSCs也具备向软骨细胞分化的能力，从而修复软骨的缺损.但是，BMSCs不像造血干细胞那样，其在骨髓中含量并不多.目前，分离培养BMSCs常用的方法包括全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心培养法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法等 ［14］，后两种方法虽可获得较为纯化的BMSCs，但由于BMSCs的自身特点，因其特别脆弱，在分选过程中，机械剪切力和高能激光可造成BMSCs的损伤，对其生物学特性、功能、活性、细胞形态等都会造成很大的影响.同时这两种分离法的实验要求较高，所用仪器及试剂昂贵，难以广泛应用；而前两种方法是目前分离培养BMSCs最常用的方法，其中密度梯度离心法主要有Percoll分离液分离法和Ficoll分离液分离法，二者原理基本相同，都是将骨髓组织进行密度分离，但分离液成分及各自工作液密度不同，Ficoll分离液工作的密度为1.077 g/mL.实验采用密度可调的Percoll分离液，离心3000 r/min，30 min后取骨髓细胞悬液中间的白膜层，所获细胞种类较单一，降低了分离液细胞中杂质细胞的比例，从而提高了BMSCs的纯度.但是，骨髓液中含有较大量的红细胞，近几年来，国内外有学者找到一种方法，来提高BMSCs的纯度，他们向骨髓液中加入红细胞裂解液，把红细胞裂解掉，从而提高了分离纯化BMSCs的效率，希望获得纯度较高、数量较多的BMSCs ［15］.这种方法建立在全骨髓贴壁培养法的基础上，具备全骨髓贴壁培养法的全部优点，但是，红细胞裂解液法能够获得纯度较高的BMSCs，而且比全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法得到的BMSCs量更多，同时并不影响其生物学活性，是一种简便、可行的BMSCs分离方法.红细胞裂解液法是在全骨髓贴壁培养法的基础之上优化而来，能够较早的观察到骨髓间充质干细胞的形态，而且红细胞裂解液法能够得到纯度较高的BMSCs，同时能为BMSCs提供营养.用红细胞裂解液法来分离纯化BMSCs的优点如下：①用红细胞裂解液法，骨髓液中含有各种促进BMSCs的生长因子 ［15－16］.这是因为用红细胞裂解液处理后，红细胞裂解液能够裂解红细胞及血小板，从而把它们胞浆内丰富的促BMSCs的生长因子释放出来，这些细胞因子可促进BMSCs的成集落生长，为BMSCs提供更适宜的生长微环境，从而使BMSCs生长更快 ［17］.②用红细胞裂解液法，可以增加BMSCs的浓度，提高BMSCs的增殖速度.由于骨髓液中其它细胞明显减少，通过离心可以得到纯度较高的含有BMSCs的骨髓液，从而明显减少BMSCs的原代培养的时间，提高BMSCs的增殖速度.③能够较早的促进BMSCs的贴壁.研究显示用红细胞裂解液法，早期BMSCs的贴壁较高.这是因为使用红细胞裂解液法，使影响BMSCs贴壁的红细胞及血小板数量大量减少，为BMSCs贴壁留出更多的空间，以利于BMSCs的较早贴壁［18］.

3　BMSCs的鉴定

BMSCs的鉴定包括BMSCs的形态学特征、表面标记蛋白、超微结构和多向分化能力等.通过透射电子显微镜分析法，逆转录酶聚合酶链式反应（PCR）分析法、免疫组织化学染色法、流式细胞术、alamarBlue试验、组织学染色和定量PCR分析法来观察细胞、鉴定细胞.BMSCs来源于具有很强多向分化潜能的中胚层，从细胞的形态学观察，BMSCs形态像成纤维细胞，贴壁生长为长梭型细胞，原代及传代细胞之间的形态较均一.培养的BMSCs贴壁能力很强，其中，原代细胞出现集落生长，传代细胞培养时，可以表现出较强的增殖性能.BMSCs的表面抗原标志，具有非专一性的特征，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面抗原标志.它的表面抗原SB10、SH2、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD120a和CD124等均呈阳性反应，且阳性率不一；而对CD14、CD34、CD45等表面抗原均呈阴性反应.但是，到目前为止，还没有发现BMSCs的具有特异性的表面抗原标志.

4　研究前景

大量的临床试验证实，一些报道显示关于病人的症状预后有很好的结果.但是，自体软骨细胞移植被证明对于小于45岁的患者比大于45岁的患者更有效 ［19］.人的BMSCs可以向软骨细胞方向分化，有很大的潜力来修复软骨缺损为OA和其它的关节疾病.然而，人们还一直不清楚软骨形成的分子机制.在细胞培养中，我们跟随着一个双重稳定的被氨基酸同位素（SILAC），通过向软骨分化的第一步评估人BMSCs分泌蛋白质的量.Kopen等 ［20］将提取较纯的BMSCs接种在幼年小鼠的侧脑室中，试验显示BMSCs在侧脑室内发生了转移，其中在海马、嗅球、纹状体等结构中，均有BMSCs来源的神经胶质细胞和神经元细胞的高效表达.这种现象提示我们可以用BMSCs来治疗神经退行性的疾病和中枢系统受损等疾病的可能.杨晓凤等 ［21］的研究结果表明，经动脉BMSCs移植可以治疗股骨头坏死.而其关键之一是种子细胞的开发，即如何能大量地获取原代细胞用于修复骨、软骨缺损.由于同种异体移植供体来源受限，而使其应用受到很大的局限.成人的骨髓中BMSCs量很少，但是有高功能的不同方向分化的能力，能分化为特定的组织像骨、软骨、肌肉、脂肪组织、韧带、皮肤、骨髓基质、肌腱和其他组织.在体内移植，BMSCs也分泌多种生长因子、免疫调节细胞因子和重要的生物活性大分子包括构成再生微环境细胞来源的外来体.这个实验通过小鼠模型描述了成人的BMSCs使软骨形成或再生 ［22］.而在关节科，利用BMSCs来修复关节软骨的缺损的也已成为关节外科医师研究的重中之重.

5　结语

骨髓间充质干细胞在组织工程中的研究越来越成为目前研究的热点.红细胞裂解液法，能够成功分离出BMSCs，并得到有效的鉴定.运用组织工程学的原理，使BMSCs对软骨缺损的修复成为了可能，给临床医生带来了很大的希望.