结核分枝杆菌蛋白抗原的研究进展

王洁玲 唐余燕 余永胜

上海交通大学附属第六人民医院感染科，上海 200233

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是胞内寄生菌， 宿主主要依靠细胞免疫来清除感染，因此， 具有特异性免疫原性的MTB 蛋白抗原一直吸引着研究者的目光。随着近年来基因重组与蛋白纯化技术的不断发展， 已经获得多种结核杆菌蛋白，MTB蛋白具有抗原性，根据定位主要分为分泌蛋白、细胞壁蛋白和细胞浆蛋白。 现将MTB 的蛋白抗原应用研究进展综述如下：

1 MTB 分泌蛋白

1.1 6 kD 早期分泌性抗原靶（6 kD early secretory antigenic target，ESAT6）

分泌蛋白ESAT6 是从MTB 短期培养滤液中纯化分离出的蛋白质，分子量为9904 D。 ESAT6 在结核病的保护性细胞免疫反应中发挥重要作用，诱导特异性CD4+T 细胞和CD8+T 细胞（细胞毒性T 细胞，CTL）迅速增殖并释放高水平的γ 干扰素（IFN-γ），有效地激活巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内结核杆菌的生长抑制作用和杀伤能力[1-2]。 Mir 等[3]试验提示ESAT6 蛋白刺激结核杆菌感染小鼠的淋巴细胞增殖，诱导模型小鼠淋巴细胞产生大量的IFN-γ，进而降低小鼠的荷菌量，具有免疫治疗潜力，进一步试验显示它还可以协同辅助传统抗结核化疗。 ESAT6 是在MTB 早期感染中起主要作用的抗原，同时拥有T 细胞及B 细胞抗原决定簇，可诱导C57BL/6 小鼠细胞免疫和体液免疫反应增强[4]。ESAT6 抗原仅存在于致病性分枝杆菌中，卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）及其他非致病性分枝杆菌中并不存在，这一特性有助于其成为诊断MTB 感染的特异性抗原。Feng 等[5]研究表明结核患者血清中抗ESAT6 抗体含量低， 单独作为结核病血清学诊断试验意义不大， 然而ESAT6 结核蛋白可作为结核病血清学诊断的组合抗原之一。 此外，ESAT6 蛋白与MTB 致病性相关， 卡介苗在传代过程中丢失编码ESAT6 的基因， 这很可能是卡介苗对肺结核免疫保护效果不理想的原因之一， 进一步研究ESAT6 对宿主免疫调节的机制将有助于疫苗的合理没计和效果评价。Yuan 等[6]将编码EAAT6 蛋白的DNA 疫苗用于小鼠结核病模型的治疗取得了一定的效果，并能够显著降低小鼠结核病的复发率。

1.2 培养滤液蛋白10 （10 kD culture filtrate protein，CFP10）

MTB 培养滤液蛋白10 又称为Mtb b11 或Mtb SA-10，是由Rv3874（1hp 基因）编码的分子量为10 kD 的蛋白质。 CFP-10 与ESAT6 共同存在于MTB 短期培养滤液里，1hp 和esat6 基因都位于MTB 基因组RD1位点上，属同一转录单位，有学者认为这两种蛋白不仅协同表达，而且功能上也可能相辅相成。 CFP10 能够刺激机体产生特异性抗体，可以用作特异的皮肤试验抗原和血清学试验的抗原。 Essone 等[7]、Luo 等[8]用ESAT6 和CFP10 复合抗原诊断MTB 感染获得了较高的特异性和敏感性，尤其是能够区分MTB 自然感染和BCG 接种以及非致病性分枝杆菌感染。Shaban 等[9]研究表明编码CFP10 蛋白ESAT6 蛋白的多价DNA疫苗能产生显著的潜在肺免疫应答，刺激特异性T 细胞反应可激发外周血单个核细胞增殖并产生IFN-γ，降低MTB 感染小鼠模型90%的细菌载量， 其中CD4 T 细胞反应和BCG 疫苗相似，CD8 T 细胞免疫优于BCG。 另外研究表明ESAT6 和CFP10 在MTB 和HIV合并感染者的诊断中也有较高的敏感性和特异性，相信它们在作为新型诊断制剂方面将会具有广泛的应用前景[10]。

1.3 分泌蛋白MTB8.4

MTB8.4 蛋白是从结核杆菌H37Rv 株培养滤液中纯化分离得到，由Rv1174c 基因编码，其成熟蛋白（不含信号序列）分子量为8.4 kD。 低剂量MTB8.4 蛋白即可诱导机体强烈的免疫反应：一方面有效刺激机体的体液免疫，产生高水平的IgG1和IgG2；另一方面，诱导机体的CD4+Th1 型细胞免疫反应，分泌高水平的IFN-γ，并产生特异性CTL。 MTB8.4 可以成为结核病DNA 疫苗的候选抗原或亚单位疫苗的组分， 用于结核病的预防。 Xin 等[11]应用MTB8.4 构建亚单位疫苗免疫小鼠后，诱导特异性细胞免疫反应，以Th1 型反应为主，保护小鼠抵御毒性结核杆菌的攻击，获得与BCG 相似的免疫效果。 MTB8.4 适用于人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）合并MTB感染的诊断，可以作为未出现临床症状但已感染结核病的诊断标志，让患者能够早期接受治疗[12]。

1.4 分泌蛋白MPT63

MPT63 抗原是MTB 分泌的与MTB 毒力相关的小分子量蛋白，分子量为16 kD，编码基因是Rv1926c。该抗原蛋白存在于MTB 复合群中，在环境MTB 中则不存在该抗原的基因。 Mustafa[13]研究表明，MPT63 蛋白是一种特异性抗原，诱导患者机体产生Th1 型细胞免疫应答，刺激T 淋巴细胞的免疫反应和诱导IFN-γ产生，具有较强的免疫原性。 MPT63 抗原还可以诱导体液免疫， 曾被应用于牛结核病血清学诊断的研究，大多数活动性结核患者对MPT63 抗原产生高水平的抗体，检测血清抗体的敏感性和特异性分别为15.0%和98.7%，是血清学诊断试剂的必然方向[14]。

1.5 MPT64

MPT64 又名MPB64， 是最早发现的结核杆菌特异性抗原， 分子量为26 kD， 由mpt64 基因编码，占MTB 的分泌蛋白总量的8%。 研究表明，MPT64 蛋白基因在普通弱毒株BCG 中有变化， 作为疫苗的BCG中不含该抗原基因，MPT64 蛋白的这种缺失性， 能很好地使其作为血清诊断和新疫苗的候选抗原。研究发现MPT64 蛋白的T 淋巴细胞抗原表位主要在124～143 位氨基酸残基区域，MPT64 抗原具有较好的稳定性、特异性和敏感性，是用作血清学诊断试剂抗原的必然方向[15]。 该抗原可由大多数MTB 感染者机体免疫识别， 此外小鼠等动物实验结果都显示其主要诱导机体特异性CTL 的形成和IFN-γ 的分泌，可抵御MTB 的感染[16]。

1.6 MPT32

有学者从MTB 培养液中分离出MPT32， 并因它的高LI 值而定义为分泌蛋白， 进一步试验克隆相关基因， 其推导出来的氨基酸序列为：DPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPA， 因为该段序列中脯氨酸和丙氨酸所占比例较高，分别为21.7%和19.0%，故该蛋白序列的编码基因命名为apa。 MPT32 抗原与麻风分枝杆菌的纤维连接蛋白具有同源性[17]。抗原MPT32 在结核病进展早期（早于广泛空洞形成或体内胞外复制）由MTB 分泌，根据这一特性，MPT32 抗原具有早期结核病的血清早期诊断价值。 Wu 等[18]研究MTB17 种抗原在结核病血清学诊断中的应用价值， 发现MPT32能刺激机体产生特异性抗体， 并可与其他MTB 抗原形成互补，提高结核病患者尤其是菌阴肺结核及肺外结核病的阳性检出率。

1.7 抗原85（Ag85）复合物

Ag85 复合物是一组具有较强免疫活性的抗原，包括Ag85A、Ag85B 和Ag85C 三个组分，可占结核菌分泌蛋白总量的30%～40%。 Ag85 复合物能和人的纤维结合蛋白（fibronectin，FN）结合，大量存在于活动性结核病患者血清中，而非活动性结核病或其他肺部疾病患者等血清中则不存在。 Ag85 复合物黏附于细胞表面，与MTB 的致病性密切相关[19]。Ag85 复合物有分枝菌酸转移酶活性， 使海藻糖转移和沉积于细胞壁，在细胞壁合成的晚期发挥重要作用[20]。 分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85，Ag85 分子具有特异性T 细胞识别位点，Beamer 等[21]报道用MTB Ag85 复合物编码基因的质粒DNA 免疫小鼠， 诱导小鼠产生很强的细胞免疫和体液免疫反应， 能显著促进T 细胞增殖， 活化CD8+T 细胞，并产生大量白细胞介素（IL）-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等因子，能够清除MTB 的感染。Husain 等[22]用Ag85 蛋白免疫BALB/c 小鼠的试验研究表明Ag85 抗原可诱导特异性的细胞核体液免疫反应，可刺激机体产生Th1 型细胞因子，并证明可以诱导增强BCG 疫苗的免疫保护效力。

2 MTB 胞壁蛋白

MTB 细胞壁主要是结核菌蛋白、分枝杆菌酸、半乳聚糖及甘露聚糖。 由于胞壁蛋白存在于细胞的表面， 脂蛋白类抗原是引起免疫反应的一类主要抗原，如38、27、19、16 kD 等。 脂蛋白38 kD 抗原存在于多种分枝杆菌中，参与磷酸盐代谢，脂质部分锚定在质膜上，具有磷酸盐转运活性。 MTB 膜蛋白16 kD 具有结核杆菌特异的抗原表位，为小分子热休克蛋白家族成员之一。 Koz'lowska 等[23]发现38 kD 蛋白诊断活动性结核、16 kD 蛋白抗原诊断非活动性结核的效果非常好，从而提出联合应用蛋白抗原是血清学诊断发展的方向。

3 MTB 胞浆蛋白

胞浆蛋白大体有酶蛋白和应激蛋白等， 承担MTB 自身代谢及抵抗免疫系统攻击的作用。 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）由4 种相对分子量约为23 kD 的亚单位组成， 与MTB 消除活性氧基团有关，并消除宿主产生的活性氧基团以逃避机体杀伤作用[24]。 应激蛋白又称为热休克蛋白（heat shock protein，HSP），参与蛋白质转位、折叠和装配等重要胞生理活动，被称为“分子伴侣”。 热休克蛋白通过蛋白与蛋白之间的相互作用发挥许多调节功能，对细胞有保护作用。 作为抗原HSP 不适用于人类疫苗的研究，因为热休克蛋白高度保守，在不同的菌属，甚至真菌细胞的同类蛋白也有很高的同源性[25]。

综上所述，随着近年来基因重组与蛋白纯化技术的不断发展，已经获得多种结核杆菌蛋白，MTB 蛋白具有抗原性，可以诱导机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫，这些蛋白对开发结核病的诊断、皮试反应、发病机制研究以及开发新疫苗均具有重要意义。

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