酶联免疫检测抗-HCV方法的探讨与试剂的评价

王英莉

酶联免疫检测抗-HCV方法的探讨与试剂的评价

王英莉

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染导致的肝脏发生炎症坏死和纤维化的严重传染病。HCV的主要传染源有急性和慢性丙型肝炎患者及HCV无症状携带者。主要通过输血及血制品传播。血液传播是以前最主要的丙肝传播途径,不过随着献血者的筛查,此传播方式已得到明显控制,但是由于目前检查手段的原因,输血仍有传播丙型肝炎的可能,特别是反复输血、血制品者。为控制输血传播HCV,必须用敏感准确的方法对献血员献出的血液进行HCV抗体检测。第三代诊断试剂是目前使用的抗-HCV检测试剂最多的,多采用酶联免疫间接法来检测血清中HCV IgG抗体。由于IgG抗体出现的时间较晚,早期感染者采集的标本很容易被漏检；另外,还存在一定的假阳性结果,是血清中类风湿因子以及非特异性IgG的吸附等干扰造成的。

丙型肝炎病毒；丙肝抗体；酶联免疫法；双抗原夹心法；窗口期；特异性

双抗原夹心法诊断试剂借助生物素-亲和素级联放大,检测IgM、IgG等总抗体,缩短了窗口期,同时提高了试剂灵敏度。

试验原理：夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法是微孔板内预包被基因工程重组表达的HCV抗原,第一步加入生物素化HCV抗原和血清或血浆样本,样本中的HCV抗体能与包被抗原及生物素化HCV抗原相结合,形成“包被抗原-抗体-生物素化抗原”复合物；第二步加入酶标试剂,温育并洗涤后加入TMB底物显色。若样品为HCV抗体阳性,HRP催化底物显色,若样本为阴性,则不显色。加入终止液后,通过酶标仪测定吸光值(A值),从而判断样本中丙型肝炎病毒HCV)抗体的存在与否。间接ELISA法是微孔板内预包被基因工程重组表达的HCV抗原与血清或血浆中抗HCV抗体反应,再加入HRP标记抗人IgG的酶标记抗体与之结合,然后用TMB系统作用显色。

目前万泰生物药业股份有限公司生产的双抗原夹心法诊断试剂的敏感性和特异性均优于间接法,本实验室对双抗原夹心法与间接法进行了性能检测,分别采用三种试剂对7632份血浆样本同时进行检测,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 血浆样本 辽阳市中心血站2013年5月20日～11月20日献血员血浆样本共7632份。

1.2 试剂 抗-HCV间接法检测试剂：厦门英科新创股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒,批号2012085822；抗-HCV双抗原夹心法检测试剂：北京万泰生物药业股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒,批号CS20130301；确认试剂：丙型肝炎病毒抗体确证试剂盒(重组免疫印迹法) 批号：RC20131001。

1.3 方法 对于7632份样本采用双抗原夹心法与间接法同时检测抗-HCV。采用Chiron,RIBA对上述任一试剂检测为阳性或可疑的样本进行检测。

2 结果

7632份检测样本中,7597份为阴性,26份均为阳性,1份间接法检测为阴性双抗原夹心法检测为阳性,6份间接法检测为阳性双抗原夹心法检测为阴性,2份双抗原夹心法阴性而间接法检测OD值为接近临界值的可疑样本。

间接法和双抗原夹心法检测均为阳性的26份样本中,RIBA确证实验结果21例为阳性,1例为阴性,4 例为可疑；间接法检测为阳性双抗原夹心法检测为阴性的6例样本4例确证为阴性,2例确证为可疑,间接法检测为阴性双抗原夹心法检测为阳性的1例样本确证为阳性。

目前公认的检测丙肝抗体的准确方法为RIBA,以此为标准,本实验室间接法和双抗原夹心法的特异性分别统计为99.65％(7605 /7632)和99.55％(7598 /7632)。

实验结果证实了双抗原夹心法与RIBA的符合率为96.3％ ,间接法与RIBA的符合率为76.5％,抗-HCV双抗原夹心法的特异性比间接法提高了一个百分点,所产生的灰区和假阳性样本大幅度减少。

另外,间接法只检测IgG,双抗原夹心法增加了IgM的检测,因此窗口期缩短,提高了献血员抗-HCV的检出率；同时检测时加样量从间接法的10 μl提高到50 μl,大大减少了全自动加样系统的漏加率,消除了一定的安全隐患。

3 讨论

双抗原夹心法与间接法相比较有如下特点：①夹心法间接法检测IgM、IgG等总抗体检测IgG抗体窗口期缩短；②形成包被抗原-抗体-生物素化抗原复合物形成包被抗原-抗体-抗人IgG抗体复合物特异性增强；③借助生物素-亲和素级联放大原理无生物素-亲和素级联放大效应灵敏度提高；④方法学革新,加样量增加(50 μl),减少试验误差方法学限制,加样量有限(10 μl)；⑤抗-HCV ELISA检测方法在不断完善,应用双抗原夹心法检测抗-HCV,实用性强,可降低非特异性反应,提高检测准确率,缩短窗口期,更好的减少血液浪费,避免输血传播疾病。

综上所述,为了防止漏检,《献血者健康检查要求》(GB 18467-2011) 明确要求血液筛查必须用两种不同厂家试剂进行检测,因此要定期进行试剂的质量评价,正确选择检测试剂,既要增加灵敏度,又要有较高特异性,避免漏检的风险,减少血液资源的浪费,更好地为临床提供安全合格血液为患者服务[1]。

[1]何敏,朱叶,马洋,等. 抗-HCV双抗原夹心法酶联免疫检测试剂的应用评价.吉林医药学院学报,2012,66(4):244-245 .

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.03.180

2014-11-14]

111000 辽阳市中心血站