转染VEGF基因对内皮祖细胞生长的影响研究

王　伟，刘德红，李卓成，罗　蓉，许长琼，杨自华

(1.深圳市第二人民医院 检验科，广东 深圳518035；2.深圳市人民医院 检验科，广东 深圳518020)

转染VEGF基因对内皮祖细胞生长的影响研究

王伟1，刘德红1，李卓成1，罗蓉1，许长琼1，杨自华2*

(1.深圳市第二人民医院 检验科，广东 深圳518035；2.深圳市人民医院 检验科，广东 深圳518020)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0355)

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是近年来发现的一类在血管新生过程中起重要作用的前体细胞，具有干细胞的特性，可以不断增殖，并可分化为成熟血管内皮细胞[1]。EPCs在修复损伤的血管内皮方面具有极其广泛的应用价值，在心脑血管疾病[2]、缺血组织内新生血管形成[3]等方面EPCs已展示出强大的应用潜能，但来源短缺、数量稀少一直是EPCs广泛应用的一个限制因素。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一类具有强烈促进血管内皮细胞生长和分化功能的细胞因子，是EPCs增殖和定向分化不可或缺的要素之一，可以增强内皮祖细胞修复血管内皮的能力[4]。本研究通过腺病毒包装VEGF165基因转染入大鼠骨髓来源EPCs，观查转染效率及对EPCs增殖的影响，为后续实验奠定研究基础。

1材料和方法

1.1材料

DMEM细胞培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司；Ficoll密度梯度淋巴细胞分离液购自Sigma公司；VEGF购自Peprotech公司；二甲基亚枫(DMSO)、四唑蓝(MTT)细胞增殖检测试剂盒购自北京晶美生物制品有限公司；DiI-Ac-LDL购自Molecular probes公司，FITC-UEA-Ⅰ购自Sigma公司； ELISA检测VEGF试剂盒购自上海森雄有限公司。

1.2方法

1.2.1内皮祖细胞的分离和诱导大鼠经颈椎脱臼法处死后，无菌分离股骨，用消毒针头在股骨两端各穿小孔，用DMEM培养液冲洗骨髓，筛网过滤去除结缔组织块，过滤液缓慢叠加至大鼠淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，分离出中间白色的单个核细胞层。PBS洗涤3次后细胞计数，并重悬于内皮祖细胞专用培养液中(含15%胎牛血清，终浓度50 ng/ml的VEGF及100 U/ml的青霉素的低糖DMEM培养液)。按5×105/孔的密度接种于预先铺有纤维连接蛋白的24孔细胞培养板，置于37℃ 5% CO2细胞培养箱培养4天后换液弃去未贴壁细胞，继续培养7天备用。

1.2.2内皮祖细胞的鉴定诱导后的内皮祖细胞进行细胞爬片24 h后，在含有DiI-Ac-LDL(2.4 μg/ml)的无血清DMEM培养基中于37℃孵育培养2 h；PBS漂洗3次，2%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，滴加FITC-UEA-Ⅰ(10 μg/ml)并于37℃温箱孵育2 h，最后用荧光显微镜观察染色情况。

1.2.3VEGF165转染内皮祖细胞转染分三组：VEGF转染组、空载转染组及未转染对照组。其中VEGF组转染不同滴度的携带有VEGF的病毒，空载转染组转染空病毒载体，未转染对照组为不作任何转染操作的内皮祖细胞。VEGF165腺病毒重组质粒(Adv-GFP-VEGF)的构建由北京诺赛基因组研究中心完成，病毒滴度为1010/ml，稀释成106/ml备用。胰酶消化内皮祖细胞后计数；按照每孔105个细胞的密度种6孔板，按细胞病毒比1∶10、1∶50和1∶100加入不同滴度的重组腺病毒，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养2 h；每孔加入3 ml内皮祖细胞专用培养基，继续在37℃ 5% CO2细胞培养箱培养24 h，置荧光显微镜下观察转染效果，细胞呈绿色表示质粒转染成功。

1.2.4采用MTT法检测VEGF165转染后内皮祖细胞增殖情况按照前述方法，以1∶50的比例将VEGF165质粒及空载体转染入内皮祖细胞，待细胞进入对数生长期，胰酶消化细胞，PBS洗涤后重悬于内皮祖细胞专用培养基；台盼蓝染色后进行细胞计数；按每孔5×103个细胞的密度种植96孔板，在37℃ 5% CO2条件下培养，培养液中VEGF含量减半，每3-4天更换细胞培养液；第2、4、6、8、10、12、14天时加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，培养4 h；吸弃上清液后，加100 μl DMSO孵育10 min，用分光光度计读取570 nm波长处的吸光度值。

1.2.5采用ELISA法检测VEGF165转染后内皮祖细胞分泌VEGF水平VEGF165质粒转染后第2、4、6、12天取上清液检测VEGF含量，操作严格按照说明书进行。通过试剂盒所带标准品，绘制标准曲线，计算各时间点上清液中的VEGF含量。

2结果

2.1内皮祖细胞的形态观察及鉴定

新鲜分离的骨髓内皮祖细胞呈圆形，形态饱满，折光性好；培养2天后的内皮祖细胞开始贴壁，形态开始变为短梭状；3天后开始增殖，体积增大。用FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL双染色法鉴定分化中的内皮祖细胞，结果如图1，表明内皮祖细胞分化良好。

2.2VEGF165转染内皮祖细胞效率验证

由于转染质粒中带有绿色荧光蛋白，因此，转染VEGF165成功的细胞在荧光显微镜下会呈现绿色。图2为不同比例的病毒质粒转染内皮祖细胞的结果：细胞病毒比为1∶100的转染会造成细胞状态不佳，甚至死亡，而细胞病毒比为1∶10的转染成功率略差，而细胞病毒比1：50的转染不仅转染效率高(几近100%)，而且转染后细胞状态好，增殖不受影响。因此，后续实验皆以细胞病毒比1∶50进行转染。

2.3VEGF165转染后内皮祖细胞分泌VEGF含量测定

按照细胞病毒比1∶50将克隆有VEGF165的腺病毒质粒转染内皮祖细胞，采用ELISA方法检测细胞培养上清中VEGF含量，结果显示，与未转染或转染空载体的细胞相比，VEGF转染的内皮祖细胞可以分泌大量VEGF，使得细胞培养上清中VEGF含量明显高于未转染组和空载转染组，在转染后的各个时间点，差异均具有统计学意义(表1)。

图1　内皮祖细胞形态观察及鉴定

图2　VEGF165转染内皮祖细胞效率鉴定

组别转染天数(天)24612VEGF转染组4.96±0.535.67±0.644.75±0.574.24±0.46空载转染组3.23±0.34**3.16±0.31**3.05±0.28**2.78±0.32**未转染组3.15±0.31**2.98±0.37**2.94±0.33**2.87±0.29**

注：**表示与VEGF转染组相比，P<0.01

2.4VEGF165转染后内皮祖细胞的增殖测定

按照细胞病毒比1∶50将克隆有VEGF165的腺病毒质粒转染内皮祖细胞，采用MTT法测定转染后细胞的增殖情况。结果显示，空载转染并不影响细胞的增殖情况，而转染VEGF165后，细胞在第6天开始显现更强的增殖能力，第10天开始增殖能力具有统计学差异(见图3)。

3讨论

对受损血管结构和功能的修复是治疗脑血管、心血管等血管破坏性疾病的关键环节。机体在生理条件下，当血管内皮受损时，释放的炎症介质及趋化因子可以动员骨髓EPCs、招募血液中少量EPCs聚集在受损血管周围，在局部微环境下增殖、分化成为成熟的血管内皮细胞，对受损血管进行修复[5]。

图3　MTT法检测VEGF165转染内皮祖细胞后的细胞

EPCs存在于脐带血、骨髓中及外周血中，外周血的EPCs含量极低，脐带血则较难获得，因此，骨髓是研究EPCs最常用的来源。骨髓来源的单个核细胞在体外经过适当培养，可分化为具有较强增殖能力的EPCs[6]。本研究通过分离大鼠胫骨骨髓中单个核细胞，用EPCs专用培养液进行诱导培养，去除不贴壁细胞，从而获得较纯EPCs。经过FITC-UEA-I及Dil-Ac-LDL双染色鉴定，发现这些细胞具有内皮细胞定向分化的能力。

VEGF在EPCs增殖及定向分化过程中扮演重要角色，人类的VEGF基因定位于6p21.3，基因产物为一种糖蛋白，由分子质量为17000～22000的亚基组成同源二聚体[7]。根据分子量大小，人类的VEGF分为5种，其氨基酸数目分别为121、145、165、189及206个，其中VEGF165的生物学活性最强[8]。VEGF通过与EPCs上的受体特异性结合后，活化受体胞内段偶联的酪氨酸激酶，进而催化下游的信号蛋白，诱导EPCs的增殖和向内皮细胞分化[9]。介于VEGF强大的促EPCs增殖能力，我们将VEGF165转染至EPCs，让EPCs自分泌VEGF，以期EPCs具有更快的增殖能力和分化潜能。由于腺病毒载体内自带有绿色荧光蛋白基因，因此转染成功的细胞会显示自发绿色荧光，便于检测转染效果和细胞示踪。为获得最好的转染效果，我们根据文献[10]设计不同梯度的细胞病毒比，发现当细胞病毒比为1∶50时，转染效率最高，几乎达到100%，且细胞状态良好。降低细胞病毒比(如1∶10)时转染效率会随之降低，而增大细胞病毒比(如1∶100)会引起细胞的死亡，转染入细胞的蛋白基因只有表达之后才能发挥其生物活性，ELISA法检测培养上清中的VEGF含量，发现转染第二天，细胞培养上清中的VEGF含量就明显增加，显示了腺病毒载体作为转染工具的高效性[11]，且在检测的各个时间点，实验组的VEGF含量均高于对照组。而未转染组及空载体转染组检测到的VEGF水平，是培养基中添加的外源VEGF，为保持EPCs的生长所必须。为检测VEGF165转染的EPCs自分泌的VEGF对生长的影响，本研究用MTT法检测转染后各组细胞增殖能力，结果显示腺病毒空载转染的细胞与未转染质粒的细胞生长速度一致，说明腺病毒载体不影响EPCs的生长；而VEGF165转染的EPCs增殖能力显著高于对照组，说明其自身分泌的VEGF可以促进自身的增殖。该结果与曾庆娟等[12]报道的结果一致，但与王盛等[10]报道的结果不相符，可能跟实验体系中培养EPCs所用培养液中VEGF含量有关，我们在检测细胞增殖的实验中降低培养体系的VEGF含量，避免培养基中的过于足量的VEGF使得EPCs的增殖能力达到饱和，这样便于检测转染VEGF165后细胞分泌的VEGF的生物学功能。

总之，本研究通过腺病毒载体重组VEGF165转染EPCs，成功地建立了高转染率的方法体系，转染VEGF165基因的EPCs可以分泌高水平的VEGF，并展现出良好的增殖潜能，为后续EPCs的体内试验研究奠定了良好基础。

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[3]Sambataro M,Seganfreddo E,Canal F,et al.Prognostic significance of circulating and endothelial progenitor cell markers in type 2 diabetic foot[J].Int J Vasc Med,2014,2014:589412.

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[9]Everaert BR,Van Craenenbroeck EM,Hoymans VY,et al.Current perspective of pathophysiological and interventional effects on endothelial progenitor cell biology:focus on PI3K/AKT/eNOS pathway[J].Int J Cardiol,2010,144(3):350.

[10]王盛,陈忠,唐小斌,等.VEGF基因转染血管内皮祖细胞的实验研究[J].中国普通外科杂志,2008,17(8):789.

[11]Day TP,Byrne LC,Schaffer DV,et al.Advances in AAV vector development for gene therapy in the retina[J].Adv Exp Med Biol,2014,801:687.

[12]曾庆娟,尤捷,许崇永,等.人VEGF165基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响[J].浙江医学,2009,31(7):927.

112197)

摘要：目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因转染大鼠内皮祖细胞的方法，分析转染VEGF基因对内皮祖细胞生长的影响。方法分离大鼠骨髓内皮祖细胞并诱导其分化，采取FITC-UEA-I 和Dil-Ac-LDL双染色法验证；采用腺病毒包装VEGF165基因，按照不同比例转染内皮祖细胞后，通过荧光显微镜观察质粒自带绿色荧光蛋白验证转染效率；以未转染及转染空载体为对照；采用MTT法验证转染VEGF165基因对内皮祖细胞增殖的影响；采用ELISA法检测转染后细胞培养上清中的VEGF含量。结果分离诱导的大鼠内皮祖细胞分化良好，FITC-UEA-I及Dil-Ac-LDL均呈阳性；按照细胞病毒比1：50转染内皮祖细胞的转染效率最高，且细胞状态不受影响；转染VEGF165基因的内皮祖细胞能分泌大量的VEGF，提高培养上清液中的总VEGF水平，其增殖能力也明显强于空质粒转染组和未转染组。结论通过腺病毒载体转染VEGF165基因可以促进内皮祖细胞分泌VEGF，提高内皮祖细胞的增殖能力。

关键词：血管内皮生长因子；腺病毒；转染；内皮祖细胞

Experimental study of rat endothelial progenitor cells transfected with VEGF 165 geneWANGWei,LIUDe-hong,LIZhuo-cheng,etal.(ClinicalLaboratoryoftheSecondPeople'sHospitalofShenzhencity,Shenzhen518035,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the methodology of transfecting vascular endothelial growth factor (VEGF) gene to endothelial progenitor cells and detect the effect of VEGF transfection to endothelial progenitor cells.MethodsMononuclear cells from rat bone marrow were separated and induced for differentiation,and double staining of FITC-UEA-I and Dil-Ac-LDL was used to characterize the induced endothelial progenitor cells.VEGF165 gene was incorporated into adenovirus and transfected into endothelial progenitor cells according to different cell virus ratio,the green fluorescence protein was used as readout to detect the efficiency of transfection.Theproliferation of VEGF transfected endothelial progenitor cells was detected by MTT colorimetric assay,and the VEGF in the supernatant of culturing cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe endothelial progenitor cells were well induced and differentiated,both positive for FITC-UEA-I and Dil-Ac-LDL staining.Transfection using 1:50 as cell virus ratio showed the fittest efficiency and survival rate.Transfected endothelial progenitor cells secreted VEGF and up-regulated the level of VEGF in the supernatant,and the cells transfected with VEGF showed superior capacity of proliferation than vector transfected cells or non-transfected cells.ConclusionVEGF165 gene transfected endothelial progenitor cells could self-secrete VEGF and thus showed superior capacity of proliferation.

Key words:vascular endothelial growth factor; adenovirus; transfection; endothelial progenitor cell

收稿日期：(2014-03-23)

作者简介：王伟(1974-)，男，硕士研究生，副主任技师，主要从事主要从事心血管疾病炎性机制的研究。

文献标识码：A

中图分类号：Q78

文章编号：1007-4287(2015)03-0355-04

通讯作者*

基金项目：深圳市科委知识创新计划项目(JCYJ20130401104