藏药二十味肉豆蔻丸中羟基红花黄色素A的含量测定*

康新莉，顾 健，谭 睿

（1.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031；2.西南民族大学民族医院研究院，四川 成都 610051)

藏药二十味肉豆蔻丸中羟基红花黄色素A的含量测定*

康新莉1，顾 健2，谭 睿1

（1.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031；2.西南民族大学民族医院研究院，四川 成都 610051)

目的建立二十味肉豆蔻丸中羟基红花黄色素A的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法，色谱柱为Global Chromatography C18柱（250 mm×4.6 mm，5 βm），流动相为甲醇-乙腈-0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69），流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长403 nm。结果羟基红花黄色素A进样量在0.16～1.28 βg范围内与峰面积线性关系良好（r=0.999 8，n=6）；平均加样回收率为101.48%，RSD=2.56%（n=6）。结论该方法简便、准确、可靠，重复性好，可作为藏药二十味肉豆蔻丸中羟基红花黄色素A的含量测定方法。

二十味肉豆蔻丸；羟基红花黄色素A；含量测定；高效液相色谱法

二十味肉豆蔻丸为经典藏药复方，主要由肉豆蔻、沉香、丁香、降香、藏茴香、余甘子等20味藏药材组方，原质量标准仅有性状描述和简单的理化鉴别，无法有效控制药品质量[1]。相关文献报道的该药含量测定仅局限于肉豆蔻中的有效成分，但由于该复方药味较多，化学成分复杂，有必要对其他主药进行质量控制[2-8]。本试验中建立了测定方中主药红花所含羟基红花黄色素A含量的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，为其质量控制提供了可靠依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、工作站；Sartorius BS110型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ5200DE型超声波清洗仪（上海昆山超声波仪器厂）。羟基红花黄色素A对照品（批号为111637-201206，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，Sigma公司），水为超纯水（自制），其他试剂为分析纯；二十味肉豆蔻丸（西藏自治区藏医院，批号为120905；西藏昌都地区藏医院，批号为120401；西藏日喀则地区藏医院，批号为120115；四川省甘孜藏族自治州藏医院，批号为120718；西藏神猴药业有限责任公司，批号为 20120509，20130421，20140615；西藏金珠雅砻藏药有限公司，批号为120101，120603，140523)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[9-12]

色谱柱：Global Chromatography C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69）；检测波长：403 nm；柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

精密称取羟基红花黄色素A对照品8.04 mg，加25%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，摇匀，制成每1 mL中含羟基红花黄色素A 0.804 mg的溶液，作为对照品贮备液。取本品约10 g，精密称定，精密加入25%甲醇100 mL，称定质量，超声处理（功率120 W，频率40 kHz）30 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方组成比例，称取除红花的方中其他药材适量，与供试品溶液制备方法同法制备溶液，作为阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：精密吸取2.2项下3种溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定。色谱图见图1。可见，供试品溶液色谱中，在与羟基红花黄色素A对照品溶液色谱相同保留时间处有色谱峰出现，而阴性对照品溶液色谱则无此峰，说明样品中其他成分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液0.1，0.2，0.4，0.6，0.7，0.8 mL，加25%甲醇稀释定容于5 mL容量瓶中，按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以色谱峰面积(Y)为纵坐标、进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=2 213.5 X-7.976，r=0.999 8（n=6）。结果表明，羟基红花黄色素 A进样量在0.16～1.28 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，连续进样6次。结果峰面积的 RSD=1.86%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密称取同一样品（西藏昌都地区藏医院，批号为120401）6份，依法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析。结果平均含量的 RSD=1.90%（n=6），表明方法重复性良好。

图1 高效液相色谱图

稳定性试验：取同一供试品（西藏昌都地区藏医院，批号为120401）溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h时依法进样。结果峰面积的 RSD=1.11%（n=7），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品（西藏昌都地区藏医院，批号为120401）6份，每份约1.00 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，分别加入0.48 mg羟基红花黄色素A对照品，并加入25%甲醇10 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法进样测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 羟基红花黄色素A加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取10批样品，依法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，以峰面积计算羟基红花黄色素A的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

本试验中以羟基红花黄色素A为含量考察指标，分别以水、25%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇为溶剂，超声30 min进行试验，结果表明，25%甲醇的提取含量较高，故选作样品的提取溶剂；同时，对样品提取方式及时间进行了系列考察，结果显示，回流和超声对提取率的影响不大，且超声提取操作比较简便，且30 min基本上可将羟基红花黄色素A提取完全，故选用超声提取30 min作为提取方法。

选择流动相时，对比了不同流动相的分离效果及峰对称因子、理论板数等，如甲醇 -乙腈-0.5%磷酸水（26∶2∶72）、甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液（26∶2∶72）、甲醇-乙腈-1.0%磷酸水溶液（26∶2∶72）、甲醇-乙腈 -0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69），结果表明，以甲醇-乙腈 -0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69）为主流动相时，主峰峰形较好且保留时间短、分离度好，且方中其他成分对羟基红花黄色素A的含量测定无干扰。

藏药二十味肉豆蔻丸所含药味较多，成分复杂，本试验中仅对10批样品进行含量测定，存在一定的局限性。综合考虑，暂定二十味肉豆蔻丸中每1 g含羟基红花黄色A（C27H32O16）应不得少于0.45 mg。

总之，本试验中所建立的含量测定方法不仅操作简单、准确，且重复性好，可用于二十味肉豆蔻丸的质量控制。

[1]WS3-BC-0164-95，中华人民共和国卫生部药品标准·藏药(第一册)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：142-143.

[3]扈晓佳，殷 莎，袁婷婷，等.红花的化学成分及药理活性研究进展[J].药学实践杂志，2013，13（3）：161-168.

[4]袁子民，陈剑锋，贾天柱.RP-HPL测定麸煨肉豆蔻中去氢二异丁香酚的含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（18）：60-61.

[5]谭 锐，张 良.藏药二十味肉豆蔻丸中丁香酚的HPLC测定[J].中国药事，2003，17（4）：224-225.

[6]陈常莲，胡斯乐.HPLC测定蒙药德都红花七味丸中羟基红花黄色素A的含量[J].中国中药杂志，2012，37(23)：3 673-3 675.

[7]范 莉，赵海誉，濮 润，等.红花的黄酮类化学成分研究[J].中国药学杂志，2011，46（5）：333-337.

[8]姜建双.红花化学成分及生物活性研究[D].北京：北京协和医院，2008.

[9]赵明波，邓秀兰，王亚玲，等.高效液相色谱法测定红花中的羟基红花黄色素A[J].色谱，2003，21（6）：593-595.

[10]姚苗苗，任爱农，董仲才.RP-HPLC法测定红花中羟基红花黄色素A的含量[J].药物分析，2010，12（2）：263-265.

[11]顾武军，陈宗良.高效液相色谱法测定脑得生胶囊羟基红花黄色素A含量[J].中国药业，2012，21（6）：33-34.

[12]徐如英，童树洪.红花的化学成分及药理作用研究进展[J].中国药业，2010，19(20)：86-87.

Content Determination of Hydroxysaffor Yellow A in Tibetan Medicine Ershiwei Roudoukou Pills

Kang Xinli1,Gu jian2,Tan Rui1
(1.Southwest Jiaotong University,Chengdu,Sichuan,China 610031; 2.Southwest University for Nationalities,Chengdu,Sichuan,China 610051)

Objective To establish a method for the content determination of the hydroxysaffor yellow A in Ershiwei Roudoukou Pills.Methods The determination was performed by HPLC method on Global Chromatography C18column（250 mm×4.6 mm,5 μm）at the wavelength of 403 nm using methanol-acetonirile-0.5% phosphoric acid-water(29∶2∶69)as the mobile phase.The column temperature was 30℃ and the flow rate was 1.0 mL/min.Results The linear rang of hydroxysaffor yellow A was 0.16-1.28 μg and the average recovery rate was 101.48%,RSD=2.56%（n=6）.Conclusion The established methods is simple,convenient and accurate with good reproducibility,and can be applied to determine the content of hydroxysafflor yellow A in Tibetan Medicine Ershiwei Roudoukou Pills.

Ershiwei Roudoukou Pills;hydroxysafflor yellow A;content determination;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2015)19-0039-02

康新莉，女，在读硕士研究生，药师，研究方向为民族药物资源评价，（电子信箱）1315356502＠qq.com；谭睿，女，博士研究生，教授，研究方向为中药质量标准规范化和新制剂研发，本文通讯作者，（电话）028-8734667（电子信箱）tanrui＠swjtu.edu.cn。

2015-04-23)

β重大新药创制国家科技重大专项“中药新药安全性检测技术与标准研究”子课题，项目编号：2014ZX09304307001-019；国家药典委员会“2011-2012年度国家药品标准提高工作(中药)科研立项”，项目编号：892。