跌打片质量标准提高研究

单秀明，杨 晓，邱学伟

(山东省青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071)

跌打片质量标准提高研究

单秀明，杨 晓，邱学伟

(山东省青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071)

目的建立跌打片成分定性、定量分析方法以提高其质量标准。

跌打片；质量控制；薄层色谱法；高效液相色谱法

跌打片是中药复方制剂，由三七、续断、血竭等24味中药组方，具有活血化瘀、消肿止痛的功效，临床上用于跌打损伤、筋断骨折、瘀血肿痛、闪腰岔气等[1]。该制剂现行标准中只有性状、显微鉴别和检查，但无薄层鉴别及含量测定项。为更好地控制该制剂的内在质量，现建立了鉴别三七、续断、血竭等8味药材的薄层色谱（TLC）法，测定君药续断中川续断皂苷Ⅵ的含量的高效液相色谱（HPLC）法，现报道如下。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，包括真空脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器及 LC solution色谱工作站；BP211D型电子天平（Sartorius公司）；HHW-4型双显恒温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）；AUTO Science AS10200BT型超声波清洗器（杭州汇尔仪器设备有限公司）；硅胶G预制薄层板（德国 MN，批号 707183）。三七对照药材（批号 120941-200506）、人参皂苷Rb1对照品（批号110704-200420）、三七皂苷 R1对照品（批号110745-200415）、人参皂苷 Rg1对照品（批号110703-200424）、续断对照药材(批号121033-200608）、川续断皂苷Ⅵ对照品（批号110708-200505）、芍药苷对照品(批号110736-200732)、血竭对照药材（批号120906-200308）、枳实对照药材（批号 120936-200404）、骨碎补对照药材（批号121169-200503）、柚皮苷（批号 110722-200610）、橙皮苷（批号110721-200512）、新橙皮苷（批号111857-201102），均购自中国食品药品检定研究院；跌打片（批号为 0804001，0804002，0804003，天津中新药业有限公司）；乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

三七、续断：取本品15片，除去糖衣，研细，加甲醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20 mL，正丁醇液再用正丁醇饱和的水 20 mL洗涤，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，得供试品溶液。另取三七、续断对照药材各0.2 g[1-2]，分别加甲醇20 mL，同法得对照药材溶液。取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品、三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。取川续断皂苷Ⅵ对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取处方中除去三七的其他药味，按处方比例制成缺三七的阴性对照样品；再取处方中除去续断的其他药味，按处方比例制成缺续断的阴性对照样品；按供试品溶液的制备方法分别制成阴性对照品溶液。依据 2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB方法，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液各1～5 μL，对照药材溶液与对照品溶液各1 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液为展开剂[3-4]，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点或荧光斑点，阴性无干扰(见图1A及图1B)。

血竭：取本品10片，除去糖衣，研细，加乙醚10 mL，密塞，超声处理5 min，滤过，滤液作为供试品溶液[5-6]。另取血竭对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。取处方中除去血竭的其他药味，按处方比例制成缺血竭的阴性对照样品，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(19∶1)为展开剂[4，7]，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的主斑点，阴性无干扰(见图2)。

白芍、赤芍、牡丹皮：取本品10片，除去糖衣，研细，加甲醇50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30 mL，弃去水液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇1 mL使溶解，置中性氧化铝柱（100～200目，5 g，内径1～1.5 cm）上，用甲醇50 mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[3-4]。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取处方中除去牡丹皮、白芍、赤芍的其他药味，按处方比例制成缺牡丹皮、白芍、赤芍的阴性对照样品，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述3种溶液各2～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性无干扰(见图3)。

图1 三七及续断薄层色谱图

图2 血竭薄层色谱图

图3 牡丹皮、白芍、赤芍薄层色谱图

枳实、骨碎补：取本品2片，除去糖衣，研细，加甲醇15 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。另取枳实对照药材0.02 g、骨碎补对照药材0.04 g，同法分别制成对照药材溶液。取橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1 mL各含0.05 mg的溶液，作为对照品溶液[8-9]。再取处方中除去枳实、骨碎补的其他药味，按处方比例制成缺枳实、骨碎补的阴性对照样品。同供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述7种溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视[3]。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰(见图4)。

图4 枳实、骨碎补薄层色谱图

2.2 川续断皂苷Ⅵ含量测定

2.2.1 色谱条件[1，10-11]

色谱柱：KromasilTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水，梯度洗脱，0～20 min流动相A 20%→40%、流动相B 80%→60%，20～35 min流动相 A 20%、流动相 B 80%；流速：1.0 mL/min；检测波长：212 nm；柱温：35℃；进样量：20 μL。

2.2.2 溶液制备

精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含川续断皂苷Ⅵ70 μg，即得对照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取0.15 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率 300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例取除续断的其余药材，按供试品制备工艺、供试品溶液的制备方法，得阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性考察：照拟订色谱条件，分别精密吸取2.2.2项下3种溶液各20 μL，注入液相色谱仪。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有一相同的色谱峰，而阴性样品溶液色谱则无此峰，说明其他组分对待测成分的测定无干扰。色谱图见图5。

线性关系考察：精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品18.57 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液，各进样5，10，15，20，25，30，35 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。以对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为 Y=14 579 X-756.24，r= 0.999 9（n=7）。结果表明，川续断皂苷Ⅵ进样量在 0.347 3～2.430 8 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液 20 μL，重复进样6次。结果的 RSD为0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品（批号为 084001）溶液20 μL，在相同的色谱条件下于0，3，7，10，13，15 h时测定。结果的RSD为0.87%（n=6），表明供试品溶液于15 h内基本稳定。

图5 高效液相色谱图

重复性试验：称取样品（批号为084001）共6份，精密称定，依法测定川续断皂苷Ⅵ含量。结果的 RSD为0.95%（n=6），表明方法重复性较好。

加样回收试验：取已知含量的同一批样品（批号为084001）20片，除去糖衣，精密称定，研细。精密称取3组（每组3份）已知含量的供试品粉末0.05，0.07，0.09 g，分别加入一定量川续断皂苷Ⅵ对照品，按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 川续断皂苷Ⅵ加样回收试验结果（n=9）

2.2.4 样品含量测定

取3批跌打片样品(批号为0804001，0804002，0804003），依法测定，结果3批样品中川续断皂苷Ⅵ的含量分别为每片4.1，4.0，4.0 mg。

3 讨论

关于展开剂的选择，分别选用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下层溶液[3]、正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）[3]、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液[4]3种不同的展开剂，经过大量试验，最终选择三氯甲烷 -甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液作为展开剂，分离效果较好，阴性无干扰，且可同时鉴别三七、续断2味药材，避免造成结果误判。

通过对比试验发现，相对湿度应在60%以下，且相对湿度越低,三七皂苷R1与川续断皂苷Ⅵ分离效果越好。三七、续断供试品点样量为 5 μL时，更易观察到三七皂苷R1的斑点；点样量为1 μL时，供试品中川续断皂苷Ⅵ的理论含量与续断对照药材基本相当，更便于川续断皂苷Ⅵ斑点的观察。故建议操作者根据样品实际情况，在同一薄层板上采用不同点样量试验。

血竭为进口贵重药材，由于进口药材来源有限，中药材市场常有伪劣品出现[5]。为有效控制跌打片中血竭的投料质量，建立了以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10）为显色剂的薄层色谱定性研究方法。结果表明，经显色的供试品溶液色谱图中血竭的特征斑点清晰，阴性无干扰，明显优于其他方法[1]，快速、有效、灵敏度高、专属性强。

白芍、赤芍和牡丹皮的鉴别试验结果表明，三者均可检出丹皮酚，且除去上述药材所得到的阴性对照品溶液的色谱图对丹皮酚的检出存在干扰。为初步控制3味药材的投药质量，最终以芍药苷作为对照品，对处方中白芍、赤芍、牡丹皮投药情况进行定性考察，具有一定的实际意义。

枳实、骨碎补的TLC鉴别试验中，采用聚酰胺薄膜作为薄层板，以三氯甲烷-丙酮 -甲醇(5∶1∶1)为展开剂[1]，对同时鉴别枳实、骨碎补中的橙皮苷、新橙皮苷与柚皮苷等活性成分有良好的色谱分离效果，明显优于其他方法[4]。分离效果好、灵敏度高、专属性强。

关于含量测定中流动相的选择，最初以乙腈-水（30∶70）为流动相，由于本组方药味多，干扰严重，未取得满意的分离效果。根据样品的分离情况，参照文献[1，10-11]，最终选择梯度洗脱，分离效果良好。

[1]WS3-B-3001-98，卫生部药品标准·中药成方制剂（第15册）·跌打片[S].

[2]张 丹，曹纬国，陶燕铎.不同炮制方法对续断中总皂苷和川续断皂苷Ⅵ含量的影响[J].重庆医科大学学报，2010，35（7）：1 054-1 057.[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅥB.

[4]吕武清，龙新华.中成药中的药材薄层色谱鉴别[M].北京：人民卫生出版社，1997：12-13.

[5]葛美婷，胡双丰.血竭与龙血竭的定性鉴别[J].中国药业，2010，19（22）：85.

[6]吴敏姿，吴 锋，叶端炉.大七厘散中血竭、大黄的薄层色谱鉴别[J].中国药业，2005，14（10）：64-65.

[7]胡颖菲，陆兔林，毛春芹，等.大柴胡颗粒质量标准研究[J].中成药，2013，35（1）：68-73.

[8]高 颖，房德敏.骨碎补黄酮类化合物的研究进展与开发前景[J].中草药，2009，40（2）：161-164.

[9]黄爱华，曹 骋，曾元儿，等.HPLC法测定不同规格酸橙枳实中新橙皮苷和柚皮苷的含量[J].药物分析杂志，2009，9（29）：48-50.

[10]杨武德，彭娇平，冯 静.高效液相色谱法测定不同产地续断中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].中国医院药学杂志，2011，31(17)：1 469-1 471.

[11]刘京晶，郭宝林，黄文华，等.HILIC-HPLC测续断药材中多种皂苷含量[J].中国中药杂志，2011，36(17)：2 367-2 371.

Study on the Quality Standard of Dieda Tablets

Shan Xiuming,Yang Xiao,Qiu Xuewei
(Qingdao Institute for Drug and Food Control,Qingdao,Shandong,China 266071)

Objective To establish the qualitative and quantitative methods to improve its quality standard of Dieda Tablets.Methods TLC was applied to the identification of Notoginseng Radix et Rhizoma,Dipsaci Radix,Draconis Sanguis,Paeonia Radix Alba,Paeonia Radix Rubra,Moutan cortex,Aurantii Fructus ImmaTurus and Drynaria Rhizoma;HPLC was applied to determinte asperosaponin VI;the analytical column was KromasilTMC18column(150 mm×4.6 mm,5μm);the mobile phase was acetonitrile-water at the flow rate of 1.0 mL/min;the detection wavelength was 212 nm;and the column temperature was 35℃.Results The spots in the TLC were clear and could be well separated,the blank test showed that other medicine herbs had not interference with the main one;The calibration curve of asperosaponin VI showed good linearity in the range of 0.347 3-2.430 8 μg(r=0.999 9).The average recovery was 99.14%,RSD was 1.34%(n=9).Conclusion The established methods are accurate,reliable,specific and with good reproducibility.It can be used for the quality control of the Dieda Tablets.

Dieda Tablets;quality standard;TLC;HPLC

R286.0；R284.1

A

1006-4931(2015)19-0041-03

单秀明（1970-），女，大学本科，主管药师，主要从事中成药质量控制研究，（电子信箱）shanxium＠163.com。

2014-10-27；

2015-03-20)

方法 采用薄层色谱（TLC）法，建立跌打片中三七、续断、血竭、白芍、赤芍、牡丹皮、枳实和骨碎补的定性分析方法；采用高效液相色谱（HPLC）法测定川续断皂苷Ⅵ的含量，色谱柱为KromasilTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 βm)，流动相为乙腈-水(梯度洗脱)，流速1.0 mL/min，检测波长212 nm，柱温35℃。结果TLC鉴定组成斑点清晰，阴性无干扰；川续断皂苷Ⅵ进样量在0.347 3～2.430 8 βg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），平均加样回收率为99.14%，RSD为1.34%（n=9）。结论该法准确可靠、专属性强、重复性好，能有效地控制跌打片的内在质量。