膀胱感觉和运动神经支配的大鼠模型的建立及鉴定

赵建国　雷德桥　蒙德鹏　侯春林　林浩东　宗海洋　陈寅生　蔡雨卫

(第二军医大学附属长征医院骨科，上海　200003)



·论著·

膀胱感觉和运动神经支配的大鼠模型的建立及鉴定

赵建国雷德桥蒙德鹏侯春林林浩东宗海洋陈寅生蔡雨卫

(第二军医大学附属长征医院骨科，上海200003)

摘要目的：建立重建膀胱感觉和运动神经支配的SD大鼠模型并进行鉴定，为进一步研究排尿中枢重塑及其机制奠定基础。方法： 45只雌性SD大鼠随机分为对照组(n=10)、神经根切断组(n=15)和神经根吻合组(n=20)。神经根切断组大鼠，将L4以下双侧脊神经前后根全部切断；神经根吻合组在切断脊神经根后，将双侧L4神经前后根与S1相应神经根吻合；对照组不作手术处理。术后6个月，取各组大鼠，分别行尿流动力学检测、神经根电刺激、神经吻合口甲苯胺蓝染色、盆神经节注射荧光金神经示踪染色和膀胱湿质量测量。结果：神经根吻合组大鼠膀胱最大容量、残余尿量、膀胱顺应性及膀胱湿质量均小于神经根切断组而大于对照组(P<0.05)；神经根吻合组大鼠最大排尿压与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但大于神经根切断组(P<0.05)。神经根吻合组电刺激神经根后膀胱内压升高，但低于对照组(P<0.05)。神经根吻合组神经吻合口甲苯胺蓝染色可见神经纤维通过率达(53.4±6.7)%。盆神经节内注射荧光金后，神经根吻合组可见L4脊髓节段双侧灰质荧光金染色，神经根切断组和对照组未在相应脊髓节段检测到荧光金染色。结论：成功建立了同时重建膀胱感觉及运动神经支配的大鼠动物模型，为进一步研究排尿中枢重塑及其机制奠定了基础。

关键词尿流动力学；神经吻合；神经重塑；神经示踪；神经根电刺激

脊髓是排尿反射的低级中枢，也是膀胱感觉及运动信息与脑部高级排尿中枢联系的通道。脊髓损伤常造成排尿功能障碍，严重影响患者的生活质量，相关并发症是导致截瘫患者死亡的主要原因[1]。经神经途径的膀胱功能重建有望改善和恢复膀胱功能，实现意识控制下的自主排尿。但以往研究一般仅重建膀胱的运动功能，忽视了膀胱感觉功能的重建。为了形成自身对照，在动物实验中常行单侧神经根吻合，这与临床上患者的实际伤情并不一致。由于膀胱运动神经和感觉神经失去联系，仅仅重建膀胱运动神经通路难以形成真正的排尿反射，排尿低级中枢和高级中枢更难以发生移位和重塑[2]。因此，本实验同时重建大鼠膀胱的双侧感觉及运动神经支配，并通过尿流动力学、神经根电刺激、盆神经节注射荧光金神经示踪染色、吻合口甲苯胺蓝染色等方法对动物模型进行鉴定，为下一步研究排尿中枢的重塑及机制奠定了基础。

1资料与方法

1.1实验动物及分组清洁级雌性SD大鼠共45只，购自复旦大学医学院实验动物中心，体质量为180～210 g，5~6周龄。随机分为对照组(n=10)、神经根切断组(n=15)和神经根吻合组(n=20)。

1.2主要材料、试剂和仪器膀胱造瘘管(以外径为1 mm的硬膜外麻醉导管制作)；显微手术器械(北京中兴名业科技发展有限责任公司)；WZ-50C6型微量注射泵(浙江大学仪器有限公司)；荧光金(美国Biotium公司)；1%戊巴比妥钠(上海山浦化工有限公司)；M6240B多通道生理记录仪[成都仪器厂(股份合作)]；手术显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；甲苯胺蓝试剂(上海聪诚实业有限公司)。

1.3动物模型的建立神经根切断组：以1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，将SD大鼠俯卧位固定于鼠板上，剃毛、消毒，取后正中切口依次切开皮肤、皮下及深筋膜，显露棘突，向两侧钝性剥离骶脊肌，显露椎板，依次定位各脊椎平面。在10倍手术显微镜下，应用显微持针器自L3脊椎节段至S3节段咬除棘突及椎板，剪开硬脊膜，暴露脊髓及马尾神经。将L4以下所有脊神经剪断，逐层缝合切口。神经根吻合组：暴露脊髓和马尾神经后，根据椎间孔定位找到L4和S2神经根；后根较粗，可分为2束；前根较细，为1束。将L4神经根自椎间孔处剪断，同水平剪断S1神经根，将双侧L4神经前后根与S1神经相应前后根用12-0显微缝合线吻合。L4以下其余神经根全部剪断。对照组不作任何手术处理。

神经根吻合组及神经根切断组大鼠麻醉苏醒后，腹腔注射庆大霉素0.5 mg/kg，1次/d，共3 d。在通风良好的条件下分笼饲养1周后合笼，每天2次Credé手法腹部按摩以排除残余尿，自由摄食、饮水。术后6个月进行相应指标检测。

1.4尿流动力学检测将各组大鼠以1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于鼠板上，下腹部剃毛后行正中切口，依次切开腹部皮肤、皮下组织、腹肌、腹膜，暴露膀胱。尿道插入20 G静脉留置针，注入0.9%氯化钠液使膀胱充盈，于膀胱顶部用4-0丝线预置2道荷包缝线后，剪开小口造瘘，将外径为1 mm的膀胱造瘘管插入膀胱，收紧荷包缝合线后打结。拔出静脉留置针，向造瘘管内注入0.9%氯化钠液，见尿道外口有尿液流出而吻合口无渗漏，则证明膀胱造瘘成功。将造瘘管通过三通管分别连接微量注射泵和压力换能器，压力换能器与M6240B多通道生理信号仪连接。以9 mL/h速度向膀胱内灌注温度为37 ℃的0.9%氯化钠液，测量压力容积曲线，至尿道外口有尿液流出时停止灌注，此时灌注量为最大膀胱容量，尿道口排出尿液体积为排尿量，以灌注量减去排出量为残余尿量。

1.5神经根电刺激神经根吻合组大鼠及对照组大鼠俯卧位固定，行后正中切口，暴露吻合神经根和S1神经根，用刺激电极勾住神经根，刺激电极与M6240B多通道生理记录仪连接，采用正电流电刺激(电流强度5 mA，频率20 Hz，脉冲宽度为 0.3ms,持续时间为5 s)，向膀胱内注射0.9%氯化钠液至最大膀胱容量，记录电刺激时膀胱压力变化。

1.6盆神经节注射荧光金神经示踪染色取各组大鼠以微量注射器向盆神经节内注入5%荧光金10 μL，留针5 min，缝合切口，1周后处死大鼠。经 0.9%氯化钠液和4%多聚甲醛灌注固定，脊髓取材，OCT包埋，切片，厚度30 μm，在荧光显微镜下观察脊髓染色情况。

1.7神经根吻合口甲苯胺蓝染色神经根吻合组大鼠经0.9%氯化钠液及4%多聚甲醛灌注固定后，以吻合口为中心，剪取1 cm吻合神经，行甲苯胺蓝染色，根据吻合口两侧神经纤维的数量计算神经纤维通过率。

1.8膀胱湿质量测量处死各组大鼠后，经0.9%氯化钠液及4%多聚甲醛灌注固定，切取膀胱，用分析天平准确称取膀胱湿质量。

1.9统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计量资料行正态分布检验，符合正态分布的，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

神经根吻合组20只大鼠全部手术成功，术后6个月有4只大鼠因尿路反复感染、血尿而死亡。存活的16只大鼠中10只行尿流动力学检测，然后解剖神经根吻合口。由于吻合神经与周围组织粘连，仅6只大鼠完整分离出神经吻合，行神经根电刺激，之后处死，取吻合口行甲苯胺蓝染色，计算神经纤维通过率，再切取膀胱进行湿质量测量。神经根吻合组中其余6只大鼠行荧光金示踪染色。神经根切断组15只大鼠全部手术成功，术后6个月有3只死于尿路反复感染；存活的12只大鼠中6只行尿流动力学检测和膀胱湿质量测量，6只在盆神经节内注射荧光金、行神经示踪检测。对照组10只大鼠全部存活，其中5只行尿流动力学检测，并行神经根电刺激，之后处死行膀胱湿质量测量；其余5只行荧光金示踪染色。

2.1尿流动力学检测结果术后6个月，神经根吻合组大鼠膀胱最大容量、残余尿量及膀胱顺应性均小于神经根切断组而大于对照组(P<0.05)；神经根吻合组大鼠最大排尿压与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而大于神经根切断组(P<0.05)，见表1。压力容积曲线检测见神经根切断组呈一平滑曲线，排尿时无明显的压力波动；而神经根吻合组在排尿时出现明显的压力波动，与对照组相似，见图1。

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注：与神经根切断组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05

A：神经根切断组；B：神经根吻合组；C：对照组

2.2神经根电刺激检测结果神经根吻合组行神经根吻合口电刺激，可见膀胱内压明显升高，为(10.06±2.58)cmH2O，略低于对照组[(17.06±3.69)cmH2O]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3荧光金示踪检测结果神经根吻合组可见L4脊髓双侧灰质均有荧光金染色，而神经根切断组和对照组在L4脊髓均未见荧光金染色，见图3。

2.4神经根吻合口甲苯胺蓝染色结果神经根吻合组见吻合口近端神经纤维较多，排列较整齐，而吻合口远端可见神经较少，排列较紊乱，神经纤维通过率为(53.4±6.7)%，见图4。

A：神经根吻合组；B：对照组

A神经根吻合组，金黄色亮点为荧光金染色；B为神经根切断组L4脊髓节段荧光金染色，为阴性；C为正常大鼠L4脊髓节段荧光金染色，为阴性

图3荧光显微镜下荧光金示踪染色脊髓图像(×100)

A：吻合口神经纤维；B：吻合口近端神经纤维；C：吻合口远端神经纤维

2.5膀胱湿质量测量结果神经根切断组膀胱湿质量明显增大，为(1.804±0.612)g，显著大于神经根吻合组[(0.502±0.166)g]和对照组[(0.095±0.026)g],P<0.05；神经根吻合组膀胱湿质量大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

脊髓损伤造成的膀胱功能障碍不但严重影响患者的生活质量，而且可以引发泌尿系结石、感染甚至肾功能衰竭，威胁患者的生命，是临床医学亟待解决的难题[3]。恢复和改善膀胱功能的外科治疗主要包括膀胱扩大术、尿道括约肌切开术、周围肌肉代膀胱逼尿肌手术、骶神经切断术、骶神经前根电刺激术等。这些方法可在一定程度上改善膀胱的排尿和储尿功能，但手术创伤大，失败率高，适用范围窄，不能从根本上恢复膀胱神经支配，临床效果不佳[4]。重建膀胱的神经支配、恢复膀胱与排尿中枢的神经通路、实现意识支配下的排尿功能才是治愈脊髓损伤后排尿功能重建的根本途径[5]。

目前经神经途径重建膀胱功能的研究主要包括：体神经膀胱逼尿肌内种植、体神经与盆神经吻合、脊髓损伤平面上下神经根吻合、利用脊髓损伤平面下方残存的体反射重建膀胱排尿反射等[6]。然而，这些研究只重视重建膀胱的运动通路，而忽视了感觉通路的重建，重建的运动中枢与感觉中枢失去联系，难以形成排尿反射，更难以在脑部高级部位形成排尿反射的重塑，并非真正意义上的排尿反射重建，因而无法形成有意识的排尿控制，给患者生活带来了极大的不便[2]。此外，为形成自身对照，以往研究常完整保留一侧膀胱神经支配，而对另一侧膀胱支配神经进行重建，这与临床上患者的实际伤情有较大区别。因此，本研究将SD大鼠躯体神经的前、后根与支配膀胱的内脏神经前后根双侧吻合，同时重建了膀胱的运动和感觉功能。这一动物模型与临床患者的伤情更相似，也更有利于排尿反射的重建和不同水平膀胱排尿中枢的重塑。

本研究用大鼠构建膀胱功能重建的动物模型，不仅因为大鼠具有经济、易于管理等优点，更在于大鼠的排尿反射与人类相似度高，且目前相关研究多以大鼠为模型，对大鼠的解剖和生理情况的认识深入系统，可供借鉴[7]。由于雄性大鼠导尿和术后人工排尿困难，而尿液可反流入精囊，影响膀胱内压测量的准确性[8]，故本研究均采用雌性大鼠。大鼠膀胱内压的测量有经尿道插管和膀胱造瘘两种方法，由于膀胱尿道过细，选择经尿道插管更增大了尿道的阻力，使膀胱容积和内压明显高于实际水平；而膀胱造瘘虽然手术复杂，但经过一段时间的反复练习可熟练掌握，尿流动力学测量更准确[9]。在脊髓节段和神经根选择方面，前期的神经根电刺激实验及相关报道显示，支配大鼠膀胱的脊髓节段主要包括L6、S1、S2，其中又以L6和S1作用最强，电刺激L4和L5神经根没有发现膀胱内压发生明显改变[10]。由于L5神经根分束多，每束直径远远大于各骶神经根，吻合部位随机性较大，结果重复率低，而且与L6脊髓节段接近、存在神经联系，因此，本研究选择以L4神经根作为近端神经根[11]。远端选择S1神经根的原因在于，动物解剖发现S1与L6神经所形成的神经干是盆神经的主要来源；而神经根电刺激实验进一步从电生理方面验证了S1神经是支配膀胱逼尿肌的主要神经根；且S1神经根与L4神经根直径差异较小，可以实现无张力吻合而不需要行神经移植，简化了手术操作，缩短了神经再生时间，保证了神经吻合口有较高的神经纤维通过率[12]。

术后6个月，神经根吻合口的甲苯胺蓝染色发现，有一定比例的神经纤维从近端越过吻合口，说明近端躯体神经与远端支配膀胱的内脏神经发生了联系。盆神经节注射荧光金示踪剂后，于双侧L4脊髓灰质检测出荧光金染色，而神经根切断组和对照组均未于L4节段见荧光金染色，说明支配膀胱的神经中枢已移位至L4躯体脊髓中枢，从形态学角度验证了膀胱的排尿中枢在脊髓水平发生了重建[13]。本研究进行神经根电刺激时，神经根吻合组测到膀胱内压明显升高且大鼠发生排尿，膀胱内压波形与对照组相似，说明吻合神经在功能上也是完整的。尿流动力学是鉴定膀胱功能的最重要的检测手段，当膀胱内注入一定量的温0.9%氯化钠液，吻合神经根组膀胱内压发生明显变化，达到一定膀胱容量时则发生排尿，最大膀胱内压及波形与对照组相近，说明膀胱具有良好的弹性和收缩功能[14]。而神经根切断组的膀胱湿质量明显增大，最大膀胱容量及残余尿量显著高于神经根吻合组及对照组，在膀胱充盈过程中膀胱内压低，无明显波动，呈高顺应性膀胱，说明膀胱失去神经支配，无法形成排尿反射。失神经支配导致了膀胱营养代谢障碍，以致尿液持续充盈，又进一步加重膀胱的损伤，逼尿肌最终发生不可逆损伤而失去收缩功能。

综上所述，本研究成功建立了同时重建膀胱感觉和运动神经支配的动物模型，并从形态学和功能学角度对这一模型进行了验证，为进一步进行排尿中枢的重塑及机制的研究奠定了基础。同时在研究中发现，神经根吻合组膀胱最大容量、残余尿量、膀胱顺应性、膀胱湿质量仍大于对照组，说明吻合神经后在等待神经长入的过程中膀胱已经发生了损伤，而神经吻合口的检测发现，只有很少的神经纤维通过吻合口。因此，分析失神经支配后膀胱的损伤及机制、寻找逆转这一病理变化的方法并促进神经纤维的生长也是后续实验的重要内容。

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Establishment and Identification of Rat Model with Reconstruction of Bladder Sensory and Motor Innervation

ZHAOJianguoLEIDeqiaoMENGDepengHOUChunlinLINHaodongZONGHaiyangCHENYinshengCAIYuweiDepartmentofOrthopedics,ChangzhengHospital,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China

AbstractObjective：To establish and identify a SD rat model with reconstruction of bladder sensory and motor innervation, so as to lay the foundation for further study of micturition center remodeling and its mechanisms. Methods:A total of 45 female SD rats were randomly divided into control group(n=10),rhizotomy group(n=15) and nerve root anastomosis group(n=20). All the ventral and dorsal roots of spinal nerve below L4 level of rats in rhizotomy group were cut off.In nerve root anastomosis group, the bilateral ventral and dorsal roots of L4 nerve, were anastomosed with those of S1 nerve, after the spinal nerve roots had been cut off.Rats in control group were not treated with surgery. At Six months after surgery,rats in each group underwent urodynamic test,nerve root stimulation, toluidine blue staining at nerve anastomosis site,pelvic ganglia fluorescence gold tracer staining and bladder wet weight measurements. Results: Bladder maximum capacity,residual urine volume,bladder compliance and bladder wet weight in nerve root anastomosis group was less than those in rhizotomy group, however, larger than those in control group(P<0.05).There was no statistically significant difference in maximum voiding pressure between nerve root anastomosis group and control group(P>0.05), however, maximum voiding pressure in nerve root anastomosis group was larger than that in rhizotomy group(P<0.05).Intravesical pressure increased after nerve root stimulation in nerve root anastomosis group,but it was still lower than that in control group(P<0.05).Nerve passing rate was (53.4±6.7)% in nerve root anastomosis group, under toluidine blue staining at nerve anastomosis site. After injection of fluorescent gold in pelvic ganglia,fluorescence gold staining was visible in the L4 spinal cord gray matter in nerve root anastomosis group, however, not visible in rhizotomy group and control group. Conclusions: SD rat model with reconstruction of bladder sensory and motor innervation is successfully established. It lays the foundation for further study of micturition center remodeling and its mechanism.

Key WordsUrodynamics；Nerve anastomosis；Neural remodeling；Nerve tracer；Nerve root stimulation

通讯作者侯春林，E-mail：borealsky@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：10JC1418300)

中图分类号R334.3

文献标识码A