澳洲茄碱和澳洲茄胺抑制肺癌细胞的构效比较*

澳洲茄碱和澳洲茄胺抑制肺癌细胞的构效比较*

★陈来1*第一作者：陈来(1976—)，男，讲师，博士。研究方向：生物医药。E-mail：385907358@qq.com。郭权1金德忠1,2张洁1李姗姗1黄云1罗小泉1(1.江西中医药大学南昌 330004；2.南昌大学南昌 330000)

摘要：目的：探讨澳洲茄碱及其水解苷元澳洲茄胺对肺癌细胞抑制的构效关系。方法：MTT法检测澳洲茄碱及澳洲茄胺对A549和LLC细胞抑制作用；以20μg/mL的澳洲茄碱和8μg/mL澳洲茄胺分别处理A549细胞24h，观察细胞形态，并经定量PCR检测p53靶基因Bax和Puma表达水平。结果：对A549和LLC细胞，澳洲茄胺的24h IC50大约都为7.5μg/mL，澳洲茄碱的大约都为19μg/mL。形态学观察表明澳洲茄胺和澳洲茄碱处理的A549细胞都呈现细胞膜皱缩的垂死形态。定量PCR数据显示，与溶媒相比澳洲茄碱及澳洲茄胺都显著提高了p53通路Puma基因表达水平(P<0.001和P<0.05)。结论：澳洲茄碱及澳洲茄胺对癌细胞抑制量效模式相同，有效部位是苷元，作用机制是诱导细胞死亡，分子机制可能是通过上调Puma表达而激活p53信号通路。

关键词：澳洲茄碱；澳洲茄胺；肺癌；构效

龙葵全草均可入药,其生物活性成分主要包括甾体类生物碱、多糖、维生素A和维生素C等；其中,甾体类生物碱具有抗肿瘤活性[1]；又以澳洲茄碱能以诱导细胞凋亡和/或坏死的方式显著抑制肺癌细胞[2]等肿瘤的生长，但其起作用的主要有效基团及其分子机制尚需进一步探讨。澳洲茄碱的水解苷元是澳洲茄胺[3]。本课题从半致死剂量、细胞形态和p53信号通路[4]的影响等方面比较澳洲茄碱与澳洲茄胺对相同肺癌细胞的抑制作用，以探讨前体及其水解苷元之间的构效关系，从而揭示澳洲茄碱和澳洲茄胺抑制肺癌细胞的主要基团及其分子机制。

1材料与仪器

1.1试剂与仪器链霉素、青霉素、MTT粉末、胰蛋白酶、多聚赖氨酸均购自Sigma公司，DMEM购自Hyclone公司，胎牛血清购自GIBCO公司，10cm、6cm培养皿、96孔板购自NORMAX公司；BINDER CO2培养箱，Nikon ECLIPSE TS100倒置光学显微镜，VARIOSKAN FLASH酶标仪(Thermo SCIENTIFIC公司)，超声波细胞破碎仪(JY92-II型号，南京先敏仪器制造有限公司)，Roche反转录试剂盒(Roche)，LightCycler®96 SW 1.1序列检测系统(Roche)。

澳洲茄胺、澳洲茄碱的提取与纯化方法参考文献[3]，最终获得HPLC级浓度分别为94.5%和97.5%的粉末。

1.2细胞人类肺癌A549、小鼠Lewis肺癌LLC细胞株由南京大学模式动物研究所刘耕老师实验室提供。细胞以含10%FBS及1万单位/mL双抗的DMEM全培养基培养于0.5%CO2、37℃及90%左右湿度的CO2培养箱中。

1.3药物溶液的制备

1.3.1澳洲茄碱的均一溶液的制备参考文献[3]。称取50mg用DMSO溶解成浓度为44.5mg/mL的均一溶液，置于4℃冰箱避光保存、备用。

1.3.2均一澳洲茄胺醇溶液的制备。称取20mg澳洲茄胺加入5mL无水乙醇，用超声波以最大功率的17%(300瓦)超声处理1s、停2s，共处理2.8min，混悬液变得均一，但仍有肉眼勉强可视的颗粒，再加入5mL无水乙醇，经振荡处理2min后颗粒完全溶解，从而获得浓度为2000μg/mL的均一醇溶液，置于4℃冰箱避光保存、备用。

J.澳洲茄碱，a.澳洲茄胺

2方法与结果

2.1MTT法检测和比较澳洲茄胺和澳洲茄碱对肺癌细胞的抑制作用细胞以2000个/孔铺至96孔板内，空白对照、加溶媒组、加药组(澳洲茄胺从0.625、1.25、2.5、5、10到20μg/mL；澳洲茄碱从5、10、20、40、60到80μg/mL，共6个梯度)各重复5个孔，共2～3板。以100μLDMEM全培养基培养20小时后，分别换成200μL空白、含溶媒或各浓度澳洲茄胺和澳洲茄碱的DMEM全培养基，24、48、72h后各取一96孔板，吸去培养基并加入200μL含5mg/mL MTT(溶于1×PBS并过滤)的新鲜DMEM全培养基，CO2培养箱中继续培养4h。小心吸去培养液，加入150μLDMSO摇床摇5min，用酶标仪振荡20s后测各孔OD492的值。每板细胞中同一细胞的各浓度药物的抑瘤率按下面公式计算：

抑瘤率=1-(药物组OD492-空白组OD492)/(溶媒组OD492-空白组OD492)×100%

结果见图1。从结果来看，基本上澳洲茄胺和澳洲茄碱对两种恶性肺癌细胞的抑制呈现与浓度成正相关的趋势，并可以容易得出澳洲茄胺对A549、LLC细胞处理24h的IC50分别皆为约7.5μg/mL；而澳洲茄碱对A549和LLC细胞处理24h的IC50均约为19μg/mL。

2.2细胞形态观察比较实验过程参考文献[2]。A549细胞以0.8×106/皿的密度铺到6cm培养皿中，DMEM全培养基培养20h后，再加入澳洲茄胺(用DMEM全培养基稀释至终浓度为8μg/mL)及其溶媒无水乙醇(终浓度为0.4%v/v)，或澳洲茄碱(用DMEM全培养基稀释至终浓度为20μg/mL)及其溶媒DMSO(终浓度为0.045%v/v)处理24h细胞，用Nikon倒置显微镜，明场40×10倍观察细胞形态并摄像稍高于半致死剂量的澳洲茄胺处理过的肺癌细胞呈现细胞膜皱缩的垂死形态，而无水乙醇处理的细胞则形态饱满、细胞膜完整、圆润。澳洲茄碱及其溶媒处理的细胞也观察到分别与澳洲茄胺及其溶媒处理细胞相同的情形及文献[2]，结果见图2。

图28μg/mL澳洲茄胺及乙醇，或20μg/mL澳洲茄碱及DMSO处理24h后的A549细胞形态比较，比例尺：200μm。

图38μg/mL澳洲茄胺及乙醇，或20μg/mL澳洲茄碱及DMSO处理24h后的A549细胞中p53通路下游各基因表达情况比较。*P<0.05，有显著性差异；***P<0.001，有极显著性差异；N.S：P≥0.05，无显著性差异。

3构效分析与讨论

比较澳洲茄胺与澳洲茄碱对相同的两种肺癌细胞的抑制效果，可以看到，两种药物对同一种肺癌细胞的抑制效果不管从时间依赖还是从浓度依赖来看，走势都很接近，提示这两种药物对同种肺癌细胞存在相似作用模式，这一点可以从药物作用后的细胞形态变化(图2)和激活相同的信号通路(图3)获得支持；而两种药物的IC50值则分别为7.5μg/mL左右和19μg/mL左右，后者将为前者的2.5倍多一点。比较澳洲茄碱和澳洲茄胺的分子结构，可以看到，澳洲茄胺只是澳洲茄碱的苷元部分[3]，这就表明，澳洲茄胺和澳洲茄碱起相同抑制肿瘤生长效果的分子基团应该就是它们共有的苷元部分，而且前者效果是后者的两倍还多。考虑到澳洲茄胺的分子量为413.62，而澳洲茄碱的分子量为884.06，后者是前者的2倍多，这就说明澳洲茄碱水解成澳洲茄胺之后，相同质量的两种药物分子中有效苷元成分后者是前者的2.1倍多，再考虑到两者纯度上的差异(后者为94.5%，前者为97.5%)，这就与澳洲茄胺抑制肺癌细胞的IC50值是澳洲茄碱的约2.5倍相一致，因此，从分子量的比较来看，也验证了苷元部分是澳洲茄胺和澳洲茄碱抑制肺癌细胞生长的有效分子基团这一推论，不难理解，澳洲茄碱结构中的非苷元部分在对肺癌细胞生长并不起主要的作用。因此，澳洲茄碱的水解释放苷元提高了抑制肿瘤细胞的药效。肺癌是目前危害世界人民的最大恶性肿瘤之一[6-7]，而且还尚未找到有效的治疗药物[8]。我们的研究结果表明龙葵提取物澳洲茄碱的水解苷元澳洲茄胺能更有效地抑制肺癌细胞的生长，从而为缓解和治疗肿瘤病患又提供了新的潜在的药物选择。

参考文献

[1]曹熙敏，范翠丽.野生龙葵的开发利用研究进展[J].广东农业科学，2011(3):40-42.

[2]陈来，李姗姗，金德忠，等.中药龙葵提取物澳洲茄碱对肺癌细胞抑制作用[J].时珍国医国药，2015，26(2):333-334.

[3]罗习珍，陈来，刘建军，等.高效液相色谱法测定龙葵中的澳洲茄胺[J].时珍国医国药，2009,20(2):273-274.

[4]陈来，李姗姗，罗小泉，等.p53抑癌功能的研究进展[J].江西中医药大学学报，2014，26(4):93-96.

[5]陈来，胡珺，李姗姗，等.澳洲茄碱对黑色素瘤细胞的抑制作用[J].江西中医药，2014，45(12):29-30.

[6]钱桂生，余时沧.肺癌流行病学最新资料与启示[J].中华结核和呼吸杂志，2012,35(2):86-89.

[7]昌盛，代敏，任建松，等.中国2008年肺癌发病、死亡和患病情况的估计及预测[J].中华流行病学杂志，2012,33(4):391-394.

[8]杨拴盈.肺癌早期诊断的现状、困惑和希望[J].西安交通大学学报(医学版)，2011,32(1):1-5.

(收稿日期：2015-11-27)编辑：翟兴英

中图分类号：R285

文献标识码：B

*基金项目：江西中医药大学博士启动基金项目(2014BS004)；江西省大学生创新创业教育计划项目(2014)；江西省卫生厅中医药科研计划项目(2013A072)。