定量检测PAX1甲基化对于高级别宫颈癌前病变的诊断价值

林晓　徐军　徐灵　夏子茵　朱昊平

(1.上海市闵行区中心医院妇产科，上海　201199；

2.上海市计划生育科学研究所临床研究与培训中心，上海　200032)



·论著·

定量检测PAX1甲基化对于高级别宫颈癌前病变的诊断价值

林晓1徐军1徐灵1夏子茵1朱昊平2

(1.上海市闵行区中心医院妇产科，上海201199；

2.上海市计划生育科学研究所临床研究与培训中心，上海200032)

摘要目的：探讨配对盒家族基因1(paired boxed gene 1, PAX1)的甲基化定量检测对于高级别宫颈癌前病变的临床诊断价值。方法： 以病理诊断为金标准，将122例高危亚型HPV病毒感染患者分为正常宫颈组(组I，n=39)、低级别宫颈癌前病变组(组II，n=40)和高级别宫颈癌前病变组(组III，n=43)。收集各组的宫颈组织标本，采用焦磷酸测序法检测各样本中PAX1基因的甲基化水平并进行统计学分析，绘制受试者工作特性(ROC)曲线，确定PAX1基因的甲基化水平对高级别宫颈癌前病变的诊断阈值。结果：组I的PAX1基因甲基化水平为(4.77±2.43)%，组II为(3.75±2.36)%，组III为(13.51±5.31)%，差异有统计学意义 (F=23.13，P<0.001)。ROC曲线下面积为0.73。PAX1甲基化水平用于诊断高级别宫颈癌前病变的诊断阈值为4.15%，灵敏度为89. 39%，特异度为79.15%。结论：采用焦磷酸测序法定量检测宫颈组织中PAX1基因的甲基化水平能够有效诊断高级别宫颈癌前病变。

关键词宫颈癌前病变；焦磷酸测序法；配对盒家族基因1；甲基化

近20年来，细胞学筛查和HPV病毒捕获杂交法的应用使许多宫颈癌前病变和早期浸润宫颈癌得到早诊断、早治疗，从而有效降低了宫颈癌的病死率[1-3]。但是，流行病学统计表明，绝大多数HPV感染的妇女并不发生宫颈癌，说明宫颈癌发生发展过程中还有其他协同因子发挥作用，故一些分子水平的检测方法应运而生。

抑癌基因的异常甲基化可抑制抑癌基因的表达。有研究[1]表明，配对盒家族基因1(paired boxed gene 1, PAX1)的甲基化率异常升高与宫颈癌前病变的进展和宫颈鳞癌的发生密切相关。本研究旨在探索在高危型HPV阳性的人群中定量检测宫颈组织细胞中PAX1基因的甲基化对宫颈癌前病变的诊断价值。

1资料与方法

1.1一般资料和分组以2012年3月—2014年10月在上海市闵行区中心医院宫颈门诊就医的122例高危亚型HPV病毒感染者为研究对象；排除妊娠、恶性肿瘤史或免疫系统疾病史；入组前均签署知情同意书。入组时进行宫颈组织活检，收集宫颈组织以进行PAX1基因的甲基化检测，同时进行病理学诊断并以此作为诊断“金标准”。根据病理学诊断结果，将122例分为正常宫颈组(组I)39例、低级别宫颈癌前病变组(CIN I，组II)40例、高级别宫颈癌前病变组(CIN Ⅱ~Ⅲ，组III) 43例。

1.2方法

1.2.1DNA提取及化学修饰应用德国Qiagen公司生产的Omniscript RT试剂盒。抽提DNA后经亚硫酸氢盐处理。

1.2.2PCR及定量甲基化特异性聚合酶链反应(QMSP)采用PCR对目标片段进行扩增。PCR所需引物F1(快速模式1)为5’-TAT TTT GGG TTT GGG GTC GC -3’，PCR引物R1(中速模式1)为5’-CCC GAA AAC CGA AAA CCG-3’，测序引物Sl(慢速模式1)为5’-TTT TTG TTT TAG AGA GGT TAG TAA T-3’。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。完成PCR后将反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳。涉及引物均由上海生工生物工程公司合成。QMSP扩增仪为美国安捷伦公司Mx PCR系统。QMSP反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共50个循环。

1.2.3焦磷酸测序甲基化定量采用焦磷酸测序法。按照美国Bio-Rad公司测序仪中的甲基化分析要求，配置所需混合液：0.1 mol/L氨丁三醇(TAM)缓冲液(pH值为7.7)，2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mmol/L MgAc2，0.1% 牛血清蛋白(BSA)，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5’磷酸化硫酸腺苷(APS)，0.4 μg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.4 mmol/L D-虫荧光素，2×10-4U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3U/L三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3U/L无外切酶活性的Klenow DNA聚合酶，14.6 mg/L荧光素酶。然后测量样本基因的甲基化程度。将所测的PAX1基因的9个位点的甲基化程度(%)的平均值作为每份标本的甲基化程度。图1举例说明单个样本中PAX1基因9个位点的甲基化水平。

图1　单个样本中PAX1基因各位点甲基化的定量检测示例

2结果

组I平均年龄为(36.18±7.71)岁，组II平均年龄为(38.31±7.64)岁，组III平均年龄为(38.93±7.54)岁，3组间年龄差异无统计学意义(F=1.312，P=0.106)。组I、组II、组III的高危HPV病毒DNA定量平均值分别为389.85±395.71、483.23±702.79、683.28±623.75，3组间差异无统计学意义(F=1.470，P=0.203)。

组I、组II、组III的PAX1基因甲基化水平分别为(4.77±2.43)%、(3.75±2.36)%、(13.51±5.31)%。单因素方差分析表明，3组的PAX1基因甲基化水平差异有统计学意义(F=23.13，P<0.001)。采用dunnett方法进行组间多重比较发现，组I和组II之间的PAX1基因甲基化水平差异无统计学意义(P=0.317)，组I和组III(P=0.003)以及组II和组III(P=0.001)间差异有统计学意义。详见图2。

图2　3组患者PAX1基因甲基化的比较

绘制PAX1基因甲基化水平用以区分高级别宫颈癌前病变与低级别宫颈癌前病变和正常宫颈的ROC曲线，ROC曲线下面积为0.73；用PAX1基因的甲基化水平进行高级别宫颈癌前病变诊断，诊断阈值为4.15%，此时灵敏度和特异度分别为 89. 39%、79.15%。见图3。

图3　PAX1基因甲基化水平检测的ROC曲线(区分高级别宫颈癌前病变与低级别宫颈癌前病变和正常宫颈)

3讨论

近年研究发现，在宫颈癌组织中，PAX1基因的甲基化水平异常增高。台湾地区的一项研究[4]显示， 宫颈癌组织中PAX1基因甲基化阳性率达89%以上。因此，PAX1有望作为宫颈癌早期诊断的分子标志物。但大多相关研究均为定性检测PAX1基因的甲基化状态，无法对甲基化的程度进行量化判断，故在临床上只能用于浸润癌的诊断[2- 3]。

绝大部分宫颈癌是由HPV高危型病毒持续、反复感染所致，病变过程涉及病毒感染、癌前病变和浸润癌三个主要阶段，耗时可达十数年[2]。由于目前认为低级别宫颈癌前病变进展为浸润癌的几率极低，因此，及时筛查发现高级别的宫颈癌前病变是宫颈癌早期诊断和治疗的关键。既往关于抑癌基因的甲基化检测研究主要专注于浸润癌的诊断方面，而对于宫颈癌前病变尤其是高级别宫颈癌前病变的分子诊断却鲜有研究涉及[3-5]。

作为新一代DNA序列分析法，焦磷酸测序技术用于DNA序列分析时无需电泳和荧光标记，且可以同时检测多个甲基化位点并获得甲基化程度的精确定量值[6]。它不仅可以对甲基化程度进行定量测量，又具有很高的可重复性和极高的准确性，且成本也比其他高通量测序技术低[7]。本研究中焦磷酸测序结果表明，高级别宫颈癌前病变组织中PAX1基因的甲基化水平显著高于低级别宫颈癌前病变组织和正常宫颈组织；我们通过绘制ROC曲线并进行相关分析，初步确立了用PAX1基因的甲基化水平进行高级别宫颈癌前病变诊断的诊断阈值为 4.15%，为进一步开展前瞻性研究提供了数据基础。

值得注意的是，虽然本研究中所有研究对象均为HPV高危阳性且经病理学诊断确认有3个不同的病变级别，但不同病变级别患者之间HPV病毒DNA的定量值差异却无统计学意义，且标准差范围较大。这提示在宫颈疾病的筛查中，高危HPV分型更具有指导意义，而病毒DNA的定量水平并不能作为病变严重程度的依据[8]。

综上所述，在高危HPV病毒感染患者中，采用焦磷酸测序法定量检测宫颈组织细胞的PAX1甲基化水平对于诊断高级别宫颈癌前病变具有较高的灵敏度和特异度，在临床上具有潜在的应用价值。

参考文献

[1]Chang CC，Huang RL，Wang HC，et al．High methylation rate of LMX1A, NKX6-1, PAX1, PTPRR, SOX1, and ZNF582 genes in cervical adenocarcinoma [J]．Int J Gynecol Cancer，2014，24(2)：201-209.

[2]Kan YY，Liou YL，Wang HJ，et al． PAX1 Methylation as a Potential Biomarker for Cervical Cancer Screening[J]．Int J Gynecol Cancer，2014，24(5)：928-934.

[3]Lai HC，Ou YC，Chen TC，et al． PAX1/SOX1 DNA methylation and cervical neoplasia detection: a Taiwanese Gynecologic Oncology Group (TGOG) study[J]．Cancer Med，2014，42(1)：134-138.

[4]Lai HC，Lin YW，Huang TH，et al．Identification of novel DNA methylation markers in cervical cancer[J]．Int J Cancer，2008,123(1)：161-167.

[5]徐军, 徐灵, 王立峰, 等.子宫颈脱落细胞PAX1基因甲基化定量检测在子宫颈癌早期诊断中的应用. 中华妇产科杂志, 2014, 49(9): 699-701.

[6]Harrington CT，Lin EI，Olson MT，et al．Fundamentals of pyrosequencing [J]．Arch Pathol Lab Med，2013，137(9)：1296-1303.

[7]Ye MH，Chen J，Lai MD．Pyrosequencing and its application in clinical diagnosis and therapy [J]．Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2013， 42(2)：138-142.

Diagnostic Value of Quantitative Detection of PAX1 Methylation for Cervical High Grade Precancerous Lesion

LINXiao1XUJun1XULing1XIAZiyin1ZHUHaoping21.DepartmentofObstetricsandGynecology,ShanghaiMinhangCentralHospital,Shanghai201199,China; 2.ClinicalTrail&TrainingCenter,ShanghaiInstituteofPlannedParenthoodResearch,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the clinical diagnostic value of quantitative detection of the paired-boxed gene1 (PAX1) methylation for cervical high grade precancerous lesions. Methods:According to pathological diagnosis, which was set as the gold standard, 122 patients infected with high risk subtype HPV were divided to the normal cervix group(group I,n=39), the cervical low grade precancerous lesions group(group II,n=40), and the cervical high grade precancerous lesions group(group III,n=43). The cervical tissue samples from each group were collected. The methylation level of PAX1 from each sample was measured by pyrosequencing and the statistical analysis was done. The diagnostic threshold of PAX1 methylation level for cervical high-grade precancerous lesions was verified by receiver operator characteristic(ROC) curve. Results: The PAX1 methylation level of group I, group II, group III was (4.77±2.43)%, (3.75±2.36)%, (13.51±5.31)%, respectively. And the differences among them were statistically significant (F=23.13，P<0.001). The area under the ROC curve was 0.73. The diagnostic threshold of PAX1 methylation level for cervical high grade precancerous lesions was 4.15%, and its sensitivity and specificity was 89.39% and 79.15%, respectively. Conclusions: Quantitative detection of PAX1 methylation level in cervical tissue by pyrosequencing could reach effective diagnosis for cervical precancerous lesions.

Key WordsCervical precancerous lesions;Pyrosequencing;Paired boxed gene 1;Methylation

通讯作者朱昊平，E-mail: misterporky2012@outlook.com

基金项目：吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金(编号：320.6750.13152)；上海市闵行区科委研究课题(编号：2012mhz065)

中图分类号R 711.74

文献标识码A