补阳还五汤对B MP 2/4介导轴突再髓鞘化的影响

赵 鹏饶耀剑崔泽升崔家伟

（1福建中医药大学骨伤学院硕士研究生2 0 1 2级，福州 3 5 0 1 2 2；2河南省洛阳正骨医院脊柱外三科，洛阳 4 7 1 0 0 2）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI） 是脊柱外科的常见病和疑难病之一，由于中枢神经系统（central nervous system，CNS）神经元细胞损伤的不可修复性，常导致SCI患者遗留严重的神经功能障碍而难以治愈，因此促进SCI神经的再生和修复将是我们长期研究的目标。研究显示SCI很少导致脊髓神经纤维的完全离断，SCI瘫痪患者保有的感觉、运动功能跟残留神经纤维作用的发挥是密切相关的。但是，继发性损害导致残存的神经纤维脱髓鞘化，严重影响了残存神经纤维功能的发挥。因此，促进残存轴突再髓鞘化对于残留神经纤维功能的发挥有着重要的意义。少突胶质细胞 （Oligodendrocytes，OLs） 是CNS的唯一成鞘细胞，OLs形成、增殖、分化、成熟的发育过程中，骨形态发生蛋白 (Bone morphogenetic proteins，BMP)、sonic hedgehog(Shh)、Notch等三种信号通路发挥了重要的调控作用[1]。补阳还五汤（Bu yang huan wu Tang，BYHWT）是目前研究最多的治疗SCI的有效方，因此本课题用BYHWT干预BMP，来观察其对SCI残存轴突再髓鞘化的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及仪器试剂 60只体重200~250 g的SPF级SD大鼠（河南省实验动物中心 SCXK（豫） 2010-0002），PBS缓冲液，4%多聚甲醛固定液，一抗BMP2/4，电热恒温水槽等。

1.2实验分组及脊髓损伤动物模型的建立 将60只体质量200~250 g的SPF级SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、治疗组，雌雄各半，每组20只。假手术组大鼠造模时只打开胸10节段椎板，不损伤脊髓；模型组和治疗组大鼠采用改良Allen垂直打击法制作胸10节段脊髓损伤模型，打击高度5 mm，重量10 g，直径2 mm，打击后保持打击探头压迫脊髓30 S。造模成功的标志是大鼠硬脊膜无破裂，打击节段脊髓迅速充血、水肿，尾巴痉挛性摆动，针刺后肢足底无反射性肌肉收缩。

1.3术后护理及干预措施 术后各组大鼠分笼饲养，常规肛门及会阴部护理。治疗组大鼠于术后次日分别在每日早晚8时用BYHWT浓缩液（BYHWT原方水煎至95 ml制成相当于含生药1.5 g/ml的水煎剂）灌胃，每次灌胃剂量按“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算临床等效剂量，按60 kg体重人每天l剂换算，200 g大鼠等效用药剂量为4.34 g，连续灌胃28天。

1.4B B B评分及w e s t e r n b l o t检测 分别于造模前、造模后当天、造模后7天、造模后14天、造模后28天评估每只实验大鼠的BBB评分；并于造模后28天取各组大鼠胸10节段脊髓组织，用4%多聚甲醛行左心室灌注后以损伤节段为中心取长约1cm的脊髓组织，经PBS溶液漂洗3次后，经破碎、匀浆、提取、沉淀处理，电转移至硝酸纤维膜上，固定后与BMP2/4抗体杂交以显色底物。

2 结果

造模后死亡大鼠及时补充，至取标本时必须保证每组样本量为20。BBB评分数据采用SPSS18.0进行统计分析，用Quantity One软件分析条带的灰度值。各组大鼠造模前BBB评分均为21分，具有可比性，造模后各个观察点BBB评分经统计分析，结果如下表：

表1三组大鼠造模后B B B评分 ，n=6 0）

表1三组大鼠造模后B B B评分 ，n=6 0）

注：造模后当天：假手术组B B B评分略低于造模前，差异无统计学意义（P>0.0 5）；治疗组和模型组B B B评分均明显低于造模前，P<0.0 5（差异有统计学意义）；假手术组B B B评分明显高于治疗组和对照组，P<0.0 5；治疗组与对照组B B B评分比较差异无统计学意义（P>0.0 5），具有可比性。造模后7天：假手术组B B B评分与造模后当天比较，P>0.0 5；治疗组和模型组B B B评分均稍高于造模后当天，P>0.0 5；假手术组B B B评分。明显高于治疗组和对照组，P<0.0 5；治疗组B B B评分略高于模型组，P>0.0 5。造模后1 4天：假手术组B B B评分与造模后7天比较，P>0.0 5；治疗组和模型组B B B评分均稍高于造模后7天，差异无统P>0.0 5；治疗组B B B评分高于模型组，P<0.0 5。造模后2 8天：假手术组B B B评分与造模后1 4天比较，P>0.0 5；治疗组B B B评分高于造模后1 4天，P<0.0 5；模型组B B B评分略高于造模后1 4天，P>0.0 5；治疗组B B B评分明显高于模型组，P<0.0 5。

分组 当天 7天 1 4天 2 8天假手术组 1 9.0 1±0.3 9 1 9.3 9±0.5 5 1 9.5 1±0.2 3 1 9.6 9±0.1 9治疗组 1.4 4±0.2 7 3.0 9±0.6 4 6.3 8±0.7 5 1 1.0 9±0.4 3模型组 1.3 9±0.3 0 1.4 1±0.5 1 2.9 3±0.6 14.8 5±0.5 1

图2B MP 2/4western lot结果

3 讨论

脊髓损伤后残存轴突的脱髓鞘改变是SCI的常见病理改变之一。髓鞘是神经系统特有的组织结构，正常的髓鞘结构对于神经冲动快速传导等方面有着重要的意义。因此如何使损伤的轴突重新获得髓鞘化成为损伤轴突功能恢复的关键。OLs是CNS唯一的成鞘细胞，脊髓损伤后轴突脱髓鞘改变与OLs功能异常密切相关。SCI不仅导致大量神经元丢失，同时还造成OLs死亡从而引起轴突脱髓鞘改变。本课题以OLs为治疗靶点，以促进残存轴突再髓鞘化为治疗方针，探讨BYHWT对BMP2/4表达和活性的影响，从而进一步探讨BYHWT对残存轴突再髓鞘化的干预作用。BYHWT原方载于《医林改错》，具有补气活血通络的作用，对急性脊髓损伤气滞血瘀证针对性很强。现代大量研究表明：BYHWT能有效营养神经元细胞，可以明显减少神经损伤后神经元的死亡，促进神经纤维的修复[2]。近年来研究发现BMP在CNS发育中起着重要作用，在神经发育的不同阶段和CNS的不同区域调节细胞命运、增殖与分化。不同的BMP具有不同的功能 ，其中BMP2、4、7抑制神经元及OLs生成 ，而诱导II星形胶质细胞（Astrocyte，As） 的形成。少突胶质前体细胞 （Oligodendrocyte precursor cells，OPCs） 属于双潜能干细胞，可以同时向OLs和IIAs两个方向分化。脊髓损伤后损伤局部的As大量增殖，增殖的As大量表达BMP2/4，BMP2/4作用于OPCs，促进其向IIAs分化，拟制其向OLs分化，从而拟制了神经轴突髓鞘的再生[3]。本课题以中药BYHWT干预BMP2/4，发现BYHWT可以拟制BMP2/4的活性和表达，从而促进OLs的形成，拟制IIAs的形成，最终到达促进脊髓损伤后残存轴突再髓鞘化的目的，同时也起到拟制胶质瘢痕形成的作用。

BYHWT治疗SCI疗效确切，价格低廉，服用方便，副作用少，易于推广，今后我们将继续从细胞分子生物学方面探讨BYHWT治疗SCI的机制，为BYHWT的临床应用提供科学依据。

[1]王晗知，蔡文琴，肖岚.少突胶质细胞发育分化的转录调控[J].生理科学进展，2 0 0 9，4:3 5 3-3 5 6.

[2]张继平，王志彬，林爱华，等.补阳还五汤对脊髓损伤大鼠脊髓组织超微结构的影响[J].中药新药与临床药理，2 0 1 1，2:1 5 3-1 5 7.

[3]Wa n g Y.A s t r o c y t e s f r o mt h e c o n t u s e ds p i n a l c o r di n h i b i t o l i g o d e n d r o c y t e d i ff e r e n t i a t i o n o f a d u l t o l i g o d e n d r o c y t e p r e c u r s o r c e l l s b y i n c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n o f b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n s[J].N e u r o s c i，2 0 1 1,3 1(1 6):6 0 5 3-6 0 5 8.