参芪四逆汤对腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化的影响

翟建丽，石月萍

(1．辽宁医学院，辽宁锦州 121000;2．辽宁医学院附属第一医院中医科，辽宁锦州 121000)

参芪四逆汤对腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化的影响

翟建丽1，石月萍2△

(1．辽宁医学院，辽宁锦州 121000;2．辽宁医学院附属第一医院中医科，辽宁锦州 121000)

目的:观察参芪四逆汤(党参、黄芪、附子、干姜、甘草)对腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化的影响，并探讨其对心肌转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的影响。方法:采用Doering腹主动脉缩窄法复制心肌纤维化模型。8周后，检测心脏血流动力学改变，Masson染色法观察心肌组织形态学改变，免疫组化法和western-blot法检测心肌TGF-β1和CTGF表达。结果:与模型组比较，参芪四逆汤可以明显改善大鼠心功能，减少胶原纤维含量，降低心肌TGF-β1和CTGF的表达。结论:参芪四逆汤具有防治心肌纤维化作用，其保护机制可能与其抑制心肌TGF-β1和CTGF表达有关。

心肌纤维化;参芪四逆汤;TGF-β1;CTGF

心肌纤维化是一些心血管疾病终末阶段共有的病理特征，表现为心脏细胞外基质异常沉积和间质胶原增加。它是心脏病发生致命事件的一个主要生物因素，包括心脏衰竭、心律失常和心脏性猝死［1-2］，因此抑制心肌纤维化是临床中的一个关键问题。研究表明，TGF-β1诱导成纤维细胞中CTGF表达，促进胶原合成和肌成纤维细胞分化［3］，CTGF直接结合TGF-β1并增强其活性，进而结合增加的转化生长因子受体I和II［4］。研究认为，四逆汤具有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化、减轻血管损伤后内膜增生等作用［5］。补气类中药是治疗心衰的有效药物，能够减轻心室肥厚［6］。本实验采用腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化模型，观察参芪四逆汤对TGF-β1和CTGF表达的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂

0.7 mm银夹(上海奥尔科特生物科技有限公司);参芪四逆汤由党参(130701)、黄芪(130901)、附子(130801)、干姜(121201)、甘草(130501)组成，采用免煎配方颗粒剂(北京康仁堂药业有限公司);卡托普利片(H31020564，上海旭东海普药业有限公司);TGF-β1兔抗人多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司);DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(碧云天生物技术研究所);CTGF兔抗人多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司);山羊抗兔IgG抗体(美国Santa Cruz公司);改良Masson三色染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)。

1.2 动物

SPF级雄性SD大鼠40只(辽宁长生生物技术有限公司，许可证编号SCXK(辽)2010—0001)，8周龄，体质量180～220 g。在笼中饲养，可自由摄食饮水。

1.3 主要仪器

压力换能器及心功能仪器(ZS一6000型，日本生产)，3K15台式高速冷冻离心机(Sigma)，4XBC电脑型双目倒置式金相显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备及实验分组

40只8周龄雄性SD大鼠，按随机数字表法分为假手术组、模型组、卡托普利组、参芪四逆汤组每组各10只。参照Doering腹主动脉缩窄法，用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，固定、剃毛、常规消毒，在左侧肋缘下1 cm处分层打开腹腔，在左肾上缘分开后腹膜等软组织，暴露腹主动脉并在双肾上方分离腹主动脉，用银夹造成腹主动脉部分狭窄(银夹内径0.7 mm)，分层关闭腹腔，假手术组只打开腹腔，分离腹主动脉，不用银夹缩窄。术后3 d用庆大霉素肌肉注射抗感染。

2.2 给药

术后第4天，假手术组和模型组用蒸馏水(1.5 ml/100 g)灌胃，卡托普利组用卡托普利(100 mg/ kg)灌胃，参芪四逆汤组用参芪四逆汤(党参∶黄芪∶附子∶干姜∶甘草=5∶5∶5∶3∶2)5.4 g/kg灌胃，按人与动物体表面积计算，每天1次，连续8周。

2.3 指标检测

2.3.1 血流动力学测定 8周后各组大鼠腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg)麻醉，分离出右侧颈总动脉，远心端结扎，近心端剪口，将连接于压力转换器上的内径1 mm的聚乙烯管沾取石蜡油并送入左心室，即可描述左心室内压曲线，将左室内压曲线信号输入BL-420S生物信号采集处理系统，记录左室收缩压(LVSP)和左室舒张末压(LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

2.3.2 病理组织形态学观察 心肌组织在4%多聚甲醛中固定，脱水透明浸蜡包埋，制备约4 μm厚组织切片，行Masson染色(胶原纤维呈蓝色，肌纤维、胞质、红细胞呈红色，胞核呈蓝褐色)，最后中性树胶封片，光镜下观察心肌组织病理形态学变化，随机取5个视野，图像分析仪测量心肌胶原容积分数(CVF)。

2.3.3 免疫组化检测心肌TGF-β1和CTGF表达 心肌组织切片常规脱蜡至水、抗原修复，3% H2O2消除内源性过氧化物酶活性，加一抗4℃过夜，复温加二抗，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片，结果呈棕黄色即为阳性表达。每只大鼠取5张切片，随机选取每张切片中的3个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件对图像进行分析，分别计算其灰度值IOD，用均数表达强度。

2.3.4 western blot法检测心肌 TGF-β1和CTGF表达 从－80℃取出部分心肌组织加裂解液，提取蛋白，BCA法进行蛋白定量、制胶、加样、电泳，SDS-PVDF膜转印，加一抗4℃摇床过夜，TBST液洗膜，加二抗ECL显色，活体成像系统机扫描成像。用Image J软件计算分析，测定其RD值。

2.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，参数以均数±标准差(±s)表示，所有数据进行正态性和方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析，2组间均数多重比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血流动力学变化

表1显示，8周末与假手术组比较，模型组左室收缩压和左室内压最大上升及下降速率显著降低，左室舒张末压显著升高;与模型组比较，卡托普利和参芪四逆汤组左室收缩压和左室内压最大上升及下降速率显著升高，左室舒张末压显著降低，差异有统计学意义，而卡托普利和参芪四逆汤组比较差异无统计学意义。

表1 各组大鼠血流动力学比较(±s)

表1 各组大鼠血流动力学比较(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，**P＜0.01;与模型组比较:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

组别 例数 左室收缩压(mmHg)左室舒张末压(mmHg)左室内压最大上升速率(mmHg·ms－1)左室内压最大下降速率(mmHg·ms－1)假 手 术 组 10 125.69±13.96 4.75±1.81 4.28±0.68 －(4.17±0.67)模 型 组 10 85.30±17.05** 10.92±2.96** 2.23±0.76** －(2.14±0.74)**卡 托 普 利 组 10 105.89±15.24**ΔΔ 7.47±1.88**ΔΔ 3.26±0.93ˉˉΔΔ －(3.16±0.89)**ΔΔ参芪四逆汤组 10 103.80±16.68**Δ 7.53±1.86**ΔΔ 3.29±0.94*ΔΔ －(3.19±0.94)*ΔΔ

3.2 心肌组织病理学观察比较

图1表2显示，胶原纤维呈蓝色(箭头处)，心肌细胞及肌纤维呈红色，在光镜下可见，假手术组心肌胶原纤维主要分布在血管周围，心肌细胞间有少量的胶原纤维;模型组血管周围胶原纤维增厚，心肌细胞间有大量纵横交错的胶原纤维，排列紊乱;卡托普利组和参芪四逆汤组胶原纤维的量明显少于模型组。经计算分析，模型组的CVF高于假手术组，卡托普利和参芪四逆汤组的CVF低于模型组，差异有统计学意义，而卡托普利和参芪四逆汤组比较差异无统计学意义。

3.3 免疫组化法测心肌TGF-β1和CTGF的表达情况

图1 大鼠心肌组织Masson染色(×200)注:A．假手术组;B．模型组;C．卡托普利组;D．参芪四逆汤组

图2 、3及表2显示，各组心肌细胞胞质及间质中有染色为棕黄色颗粒(箭头处)的TGF-β1表达，胞核有染色为棕黄色颗粒(箭头处)的CTGF表达。用Image Pro Plus 6.0计算分析，分别测定其灰度值IOD的平均值，与假手术组比较，模型组TGF-β1和CTGF表达水平显著升高;与模型组比较，卡托普利和参芪四逆汤组的TGF-β1和CTGF表达水平显著降低，差异有统计学意义，而卡托普利和参芪四逆汤组比较差异无统计学意义。

表2 各组大鼠心肌CVF及TGF-β1和CTGF的IOD值比较(±s)

表2 各组大鼠心肌CVF及TGF-β1和CTGF的IOD值比较(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，**P＜0.01;与模型组比较:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

组 别 例数 CVF(%) TGF-β1(IOD) CTGF(IOD) 10 4.2±0.7 13.3±5.4 16.7± 8.8模 型 组 10 14.3±0.9** 48.1±13.3** 46.4±16.8**卡托普利组 10 8.1±0.8**ΔΔ 22.5± 9.8*ΔΔ 31.6± 7.7**ΔΔ参芪四逆汤组 10 7.4±0.8**ΔΔ 24.5± 7.8*ΔΔ 32.5± 9.7**ΔΔ假手术组

图2 大鼠心肌组织TGF-β1的免疫组化染色(×400)注:A．假手术组;B．模型组;C．卡托普利组;D．参芪四逆汤组

3.4 western blot法测心肌TGF-β1和 CTGF的表达情况

图3 大鼠心肌组织CTGF的免疫组化染色(×400)注:A．假手术组;B．模型组;C．卡托普利组;D．参芪四逆汤组

图4 、表3显示，假手术组心肌TGF-β1和CTGF的蛋白表达量很低，模型组最高，经卡托普利和参芪四逆汤处理后，其表达下调。用Image J软件计算分析，测定其RD值(目的条带的灰度与内参条带灰度的比值)，与假手术组比较，模型组 TGF-β1和CTGF蛋白表达量显著升高;与模型组比较，卡托普利和参芪四逆汤组TGF-β1和CTGF的蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义，而卡托普利和参芪四逆汤组比较差异无统计学意义。

图4 western blot检测大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF蛋白表达注:A．假手术组;B．模型组;C．卡托普利组;D．参芪四逆汤组

表3 大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF的RD值比较(±s)

表3 大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF的RD值比较(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，**P＜0.01;与模型组比较:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

组别 例数 TGF-β1(RD) CTGF(RD) 10 0.19±0.06 0.21±0.06模 型 组 10 0.48±0.12** 0.47±0.14**卡 托 普 利 组 10 0.32±0.08**ΔΔ 0.32±0.06**ΔΔ参芪四逆汤组 10 0.34±0.08**ΔΔ 0.30±0.08*ΔΔ假 手 术 组

4 讨论

心肌纤维化是指由各种原因导致的心肌间质心肌成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积、细胞死亡以及血管再生［7］。研究表明，心肌纤维化的形成不仅仅是胶原的沉积，且通过多种细胞因子相互作用，其中包括血管紧张素Ⅱ、转化生长因子、结缔组织生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板活化生长因子、炎性因子、5-羟色胺、胰岛素样生长因子1、细胞外基质分子［7-8］。

研究表明，TGF-β1是一类能够调节细胞生长分化的多肽，参与细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和基质的形成，能促进成纤维细胞的转化，抑制细胞外基质降解，增加细胞外基质mRNA表达和蛋白合成。研究表明，TGF-β1在心肌纤维化的过程中起重要作用，且可能是诸多因素导致心肌纤维化最后共同的中介物之一［9-10］。CTGF是TGF-β1诱导产生的，其通过自身促使纤维化和心肌肥厚的作用非常微弱，但它通过TGF-β1介导则表现出强大的致纤维化和心肌细胞肥厚效应［11-12］。有研究表明，中和 CTGF能在很大程度上减轻同种异体心脏移植所引起的慢性移植反应所致心肌纤维化，且再一次证明TGF-β1为CTGF的上游介导因子［13］。此外，TGF-β1的致纤维化效应可被CTGF反义寡核苷酸阻断［14］。

四逆汤出自《伤寒论》，有温中祛寒、回阳救逆之效。现代研究证明，四逆汤可以抑制 TGF-β1mRNA和蛋白的表达，从而防治球囊损伤内膜后血管的狭窄［15-16］。此外，四逆汤能够通过TGF-Smads通路减轻异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化，并有效改善心脏舒张功能［17-18］。另有研究证明，益气中药(党参、黄芪)具有正性肌力作用，并能逆转心衰大鼠心室重构过程［19］。黄芪注射液被证明能够改善肾性高血压大鼠血流动力学变化，从而逆转左心室肥厚及纤维化的进程［20］。

综上所述，TGF-β1和CTGF是心肌纤维化进程中2个重要的细胞因子。为此，本文探讨参芪四逆汤对腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化左室重塑及心肌TGF-β1和CTGF表达的影响。结果显示，腹主动脉缩窄术后8周末，模型组大鼠的血流动力学指标提示压力负荷大鼠心肌结构重塑、纤维化已经形成。参芪四逆汤干预治疗8周，血流动力学指标以及心肌胶原容积分数均明显改善，提示参芪四逆汤可以抑制压力负荷大鼠心肌纤维化的进展。同时，参芪四逆汤降低大鼠心肌组织中TGF-β1和CTGF的表达。此外，与同期的卡托普利治疗组比较，参芪四逆汤治疗组大鼠一般情况较好、皮毛稠密、光泽度较好、无咳嗽等症状。因此，推测参芪四逆汤可以抑制腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化的发展，可能与其抑制心肌组织中TGF-β1和CTGF的表达作用有关，但其确切机制有待于进一步深入研究。

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Effects of Shenqi Sini decoction on myocardial fibrosis in the rats with narrow constriction of the abdominal aorta

ZHAI Jian-li1，SHI Yue-ping2△

(1．Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China;2．Department of traditional Chinese medicine，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China．)

Objective:To study the effect of Shenqi Sini decoction(Codonopsis pilosula，Astragalus mongholicus，radix aconiti carmichaeli，rhizoma zingiberis，liquorice)on myocardial fibrosis rats with abdominal aorta banding，and explore its effect on the expression of transforming growth factor β1(TGF-β1)and connective tissue growth factor(CTGF)in myocardium．Methods:The models were established by partially banding of abdominal aorta according to Doering’s method．Eight weeks later，hemodynamics changes of heart were tested，the changes of myocardial tissue morphology were observed by Masson staining，the expression of TGF-β1 and CTGF were tested by immunohistochemistry method and Western blotting．Results:Compared with the model group，Shenqi Sini Decoction can obviously improve heart function of rats，reduce the content of collagen fibers and depress the expression of myocardial TGF-β1and CTGF．Conclusion:Shenqi Sini decoction can inhibit the expression of myocardial TGF-β1and CTGF，which may explain the mechanism of its protective effect on myocardium with fibrosis．

Myocardial fibrosis;Shenqi Sini decoction;TGF-β1;CTGF

R285．5

B

1006-3250(2015)04-0406-04

2014-12-05

翟建丽(1987-)，女，河南辉县人，在读硕士，从事中药对心血管疾病的防治与研究。

△通讯作者:石月萍，女，教授，医学博士，硕士研究生导师，Tel:0416-4197027，E-mail:lnjzsyp@163．com。