补肾、健脾、活血方法对骨质疏松症小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量影响*

孙 鑫，杨 芳，邓洋洋，郑洪新△，王拥军

(1．辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847; 2．上海中医药大学脊柱病研究所、上海中医药大学龙华医院，上海 200032)

补肾、健脾、活血方法对骨质疏松症小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量影响*

孙 鑫1，杨 芳1，邓洋洋1，郑洪新1△，王拥军2

(1．辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847; 2．上海中医药大学脊柱病研究所、上海中医药大学龙华医院，上海 200032)

目的:观察补肾、健脾、活血方法对骨质疏松症小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的影响，探讨中医药防治骨质疏松症的作用机制。方法:实验药物灌胃8周后，ELISA法测定股骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量。结果:补肾组、福善美组小鼠骨骼及骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶较模型组明显升高。结论:骨质疏松症的形成可能与骨及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶含量异常有关;补肾、健脾方法通过调控骨质疏松症小鼠的骨及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶含量，起到防治骨质疏松症的作用。

骨质疏松症;骨骼肌;Ca2+-Mg2+-ATP酶

骨质疏松症(Osteoporosis OP)是以骨量减少、骨组织微细结构破坏为特征，继而导致骨脆性增加和骨折危险性增高的一种全身性骨骼疾病［1］。本实验通过观察其骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量，探讨骨质疏松症“骨肉不相亲”的病理机制，即骨骼肌收缩与骨骼协调性对骨质疏松症形成的影响，并观察补肾方法、健脾方法、活血化瘀方法对骨质疏松症的防治效果和作用机制。

1 材料

1.1 动物

骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)基因敲除纯合子小鼠36只，8周龄，品系C57BL/6J，来源于上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所。野生型小鼠8只，品系C57BL/6J，来源于中国医科大学实验动物中心。

1.2 药物

补肾中药由鹿茸冻干粉与淫羊藿提取物微粉及牡蛎纳米钙微粒混合即得;健脾中药为补中益气颗粒(北京汉典制药有限公司，批号090101)，活血中药为身痛逐瘀汤(辽宁中医药大学附属一院)，阳性对照药为福善美(杭州默沙东制药有限公司，批号J20080073)，ELISA相关试剂(Ca2+-Mg2+-ATP酶试剂盒，美国ADL公司)。

2 方法

2.1 分组

野生型小鼠8只为正常组，OPG基因敲除小鼠36只按随机数字表法分为模型组8只，补肾组、健脾组、活血组、福善美组各7只。

2.2 给药

正常组及模型组小鼠正常饮食并给予纯净水灌胃，其他各组正常饮食并给予相应药物灌胃，每日1次共8周。药物剂量:小鼠等效剂量按成人(60 kg体质量)每日用药量的9倍计算［2］，容积为1ml/100 g体质量，补肾组给药量为鹿茸的0.320 g·kg－1· d－1，牡蛎0.256 g·kg－1·d－1，淫羊藿0.126 g·kg－1· d－1;健脾组给药量0.901 g·kg－1·d－1，活血组给药量9.010 ml·kg－1·d－1，福善美给药量1.5016 mg· kg－1·d－1。实验期间各组小鼠每周称重1次，并根据体质量变化调整给药剂量。

2.3 取材

实验小鼠在最后1次灌胃后，禁食24 h后取材。本实验保留标本包括右后肢腓肠肌的白肌部分和左后肢的全股骨(置塑料保鲜袋内－70℃冻存)。

2.4 ELISA法检测

将骨、骨骼肌分别放入约5倍于组织体积量的MSH缓冲液中清洗，擦干称重后，用剪刀剪碎置入匀浆瓶中，以500 rpm匀浆充分;将匀浆后的组织放入离心管中离心，2000 g×10 min;提取上清液放入1 mlEP管中，按试剂盒说明书步骤进行检测。

2.5 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析，结果以均数±标准差(±s)表示。

3 结果

3.1 模型评价

表1显示，运用双能X线吸收法对小鼠离体股骨上1/3进行检测。检测结果显示，与正常组比较，模型组小鼠离体股骨上1/3骨密度极显著降低(P＜0.01);与模型组比较，各治疗组大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度升高，其中以补肾中药组升高最为显著(P＜0.01)，其次为健脾组(P＜0.01)，说明OPG基因敲除小鼠出现骨质疏松，故模型成功。

3.2 骨保护素基因敲除小鼠骨骼、骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶检测结果

表2显示，与正常组比较模型组、健脾组和活血组小鼠骨骼的 Ca2+-Mg2+-ATP酶显著降低(P＜0.01);与模型组比较，补肾组、福善美组小鼠骨骼Ca2+-Mg2+-ATP酶明显升高(P＜0.01)，健脾组和活血组亦升高，但差异无统计学意义。

表1 各组小鼠股骨上1/3骨密度比较

表2显示，与正常组比较，模型组、健脾组和活血组小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶显著降低(P＜0.01)，补肾组和福善美组小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶显著升高(P＜0.01);与模型组比较，补肾组、福善美组小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶明显升高(P＜0.01)，健脾组和活血组亦升高但差异无统计学意义。

表2 各组小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶(mg/L)比较(±s)

表2 各组小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶(mg/L)比较(±s)

注:同表1

组 别 小鼠数 骨骼 骨骼肌正 常 组8 11.071±1.03 4.512±0.38模 型 组 8 2.121±0.14* 1.851±0.11*补 肾 组 7 9.003±1.31＊▲ 5.871±0.48＊▲健 脾 组 7 2.436±0.22*# 2.053±0.04*#活 血 组 7 2.401±0.09*# 2.001±0.18*#福 善 美 组 7 9.076±0.69＊▲ 7.413±0.64＊▲

4 讨论

骨质疏松症的发病机制复杂，肌肉无力，骨骼与肌肉运动不相协调，可能是其发病机制之一，因此本实验以此为切入点进行研究。Ca2+-Mg2+-ATP酶与肌肉收缩及能量代谢有着密切联系。该酶活性下降导致细胞内钙超载激惹出现一系列代谢紊乱，可致结构退变甚至丧失生命力，出现整个肌细胞的损伤，最终导致骨骼肌损伤［3］，而骨的负荷主要来源于肌肉的主动收缩。因此，增加肌肉的力量、弹性及身体的协调性和平衡性，可以加强骨形成和肌肉对骨骼的支持力量，进而减少骨质疏松症患者骨折的发生，提高患者的生活质量。杨芳等研究显示，不同中医治法对糖皮质激素诱导骨质疏松症大鼠的骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶存在相应的影响［4］。本实验结果表明，骨质疏松症小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶显著降低，可能是骨质疏松症发生的机制之一，运用不同的中药进行干预后，Ca2+-Mg2+-ATP酶有不同程度的升高，其中补肾中药效果最好，其次为健脾中药。先天生后天，后天养先天，肾藏精主骨生髓，脾主运化主肌肉。若脾气健运则精微充足，肌肉得养，肾精亦能得到充养，先天充盛，精充髓足则骨骼强劲;反之，脾胃虚损则四肢百骸失养，肌肉无力，可发为骨痿。因此，通过补肾、健脾法改善骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量，可能是补肾、健脾中药防治骨质疏松症的作用机制之一。

［1］刘忠厚．骨质疏松学［M］．北京:科学出版社，1998:142．

［2］施新猷．医学实验动物学［M］．陕西:科学技术出版社，1989．

［3］徐雷，杨磊，杜柳涛，等．静态负荷对大鼠离体骨骼肌能量代谢的影响［J］．中国工业医学杂志，2005，18(1):14-15．

［4］杨芳，郑洪新，王剑，等．中医不同治法对骨质疏松症大鼠骨密度及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶影响的比较研究［J］．中国骨质疏松杂志，2011，17(1):56-59．

Effect of Bushen Jianpi Huoxue Method to the Ca2+-Mg2+-ATP，enzyme content of bone and skeletal muscle in osteoporosis mice

SUN Xin1，YANG Fang1，DENG Yang-yang1，ZHENG Hong-xin1△，WANG Yong-jun2

(1．Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China; 2．Longhua Hospital of Shanghai University of TCM，Shanghai 200032，China)

Objective:To observe the effects of tonifying kidney，tonifying spleen，promoting blood flow therapies on Ca2+-Mg2+-ATP enzyme content of bone and skeletal muscle in osteoporosis mice，so as to investigate the mechanism of traditional Chinese medicine in prevention and treatment of osteoporosis．Methods:Intragastric administration was the way of medication for 8 weeks，and then the bone and skeletal muscle were taken to detemermine the content of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme by ELISA method．Results:the bone and the skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme content increased significantly in the tonifying kidney medicine group and the Fosamax group．Conclusion:The formation of osteoporosis may be related to abnormal content of bone and skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme．The tonifying kidney method，tonifying spleen method are of a preventive effect on osteoporosis through the regulation of content of osteoporosis mice bone and skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme．

Osteoporosis;Skeletal muscle;Ca2+-Mg2+-ATP enzyme

R285．5

B

1006-3250(2015)04-0416-02

2015-01-11

国家自然科学基金青年基金(81001485);国家重点基础研究发展计划(973计划)(2010CB530401);辽宁省教育厅高校杰出青年学者成长计划(LJQ2012084)

孙 鑫(1981-)，女，辽宁铁岭人，讲师，医学硕士，从事中医病因病机理论研究。

△通讯作者:郑洪新，Tel:024-31207101，E-mail:zhenghx2002 @126．com。