γ-亚麻酸产生菌的低能离子束诱变选育

刘胜男，王亚洲，石林霞，李市场，古绍彬

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)



γ-亚麻酸产生菌的低能离子束诱变选育

刘胜男，王亚洲，石林霞，李市场，古绍彬

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

为了得到γ-亚麻酸(GLA)高产菌株，以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株，利用氮离子(N+)注入诱变，并采用马来酰肼抗性筛选和红四氮唑(TTC)法相结合对突变株进行筛选。试验结果表明：当能量为10 keV时，最佳氮离子诱变剂量为1.56×1015cm-2；当马来酰肼的添加量为40 mg/L时，出发菌株的抑制率为100%；TTC法酶活测定的最佳条件为：温度35 ℃、pH为8.4、TTC浓度为8 g/L、反应时间为1 h，以此作为摇瓶初筛的条件。经过反复诱变筛选获得一株遗传稳定的高产突变株F312，其γ-亚麻酸产量为1 236 mg/L，比出发菌株(480 mg/L)提高了157.5%。

深黄被孢霉；γ-亚麻酸；低能离子束；马来酰肼；红四氮唑

0 引言

部分丝状真菌微生物含有大量的油脂，具有巨大的商业生产潜力[1]，微生物油脂近年来已成为研究热点。γ-亚麻酸(GLA)因具有重要的生理学功能而倍受人们的关注，它是合成前列腺素的前体物质，对一些疾病有积极的预防和治疗作用，如高血压、风湿性关节炎[2]、多发性硬化症[3]、精神分裂症[4]、异位性湿疹[5]、经前综合症[6]等。文献[7-8]指出γ-亚麻酸可以作为选择性抗癌剂。γ-亚麻酸是人体必需的脂肪酸，像维生素一样不能在人体内合成，必需从食物中摄取。而市售富含γ-亚麻酸的药品、保健品及食品大部分是从植物中提取，如E胶丸、保心乳等。由于月见草等富含γ-亚麻酸的植物易受气候环境条件的影响，产量不稳定，精炼成本高，无法满足市场需求，人们开始探索微生物发酵法生产γ-亚麻酸。在富含γ-亚麻酸的产油微生物育种里主要采用物理或化学诱变的方法改变遗传物质，再测定突变株发酵参数挑选并保存正突变菌株[9-10]。这种筛选方法工作量大，效率低。由γ-亚麻酸在微生物体内的合成途径可知：γ-亚麻酸是由脂肪酸脱氢酶系催化油酸、亚油酸等脂肪酸脱氢去饱和而产生的[11]；脂肪酸脱氢酶是深黄被孢霉合成GLA的关键酶，而脱氢酶的活性受到马来酰肼等物质的抑制[12]。红四氮唑(TTC)是一种氧化剂，从脱氢酶接受电子后，自身由无色被还原成红色的三苯基甲臜(TF)，从而可以表示细胞内的脱氢酶活性。通过TTC法测定脂肪酸脱氢酶酶活可间接表示深黄被孢霉生产GLA的能力。本文以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株，利用低能离子修饰技术对菌株进行诱变，并采用马来酰肼与TTC法筛选GLA高产突变菌株。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

深黄被孢霉As3.3410(购于广东微生物保藏中心)。

保藏活化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

种子培养基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO42 g/L，pH6.0。115 ℃灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖100.90 g/L，KNO31.57 g/L，乙酸钠3.42 g/L，柠檬酸钠4.56 g/L，酵母膏3.75 g/L，KH2PO42.25 g/L，MgSO47H2O 0.6 g/L，CaCl20.30 g/L，FeSO40.15 g/L，ZnSO40.20 g/L。115 ℃灭菌30 min。

活化培养：转接斜面后置于28 ℃的恒温培养箱中，培养7 d，4 ℃保藏。

种子培养：用接种环挑取一环斜面孢子，接种于种子培养基中(250 mL的三角瓶装液量为50 mL)，28 ℃、190 r/min摇床培养1 d。

发酵培养：吸取5 mL种子液接种于50 mL发酵培养基中(250 mL的三角瓶装液量为50 mL)，28 ℃、190 r/min摇床培养7 d。

1.2 菌种诱变与筛选

1.2.1 离子束诱变

用5 mL无菌生理盐水洗脱斜面孢子，制成孢子悬液，然后梯度稀释至10-5(孢子悬液浓度大约为106mL-1)。取0.1 mL稀释孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，无菌风干后进行氮离子注入。在注入机(中国科学院离子束生物工程重点实验室研究制备的LZD 900 多功能离子注入机)上，选用10 keV、15 keV两个能量级别的氮离子(N+)，以不同剂量的氮离子(N+)对风干过的孢子平板进行注入。将真空未接受离子注入的处理作为真空对照[13]。

氮离子注入后立即在超净工作台上用新鲜无菌生理盐水洗脱，进行适当的稀释，并涂布于PDA培养基平板上。每个诱变梯度做3个平行，28 ℃培养3 d，平板上长出单菌落后，进行菌落计数，计算存活率。

存活率=(诱变处理后菌落总数/对照中的菌落总数)×100%。

1.2.2 马来酰肼抗性筛选

取0.2 mL诱变后稀释到适当浓度的孢子悬液，均匀涂布于含有40 mg/L马来酰肼的PDA培养基平板上，28 ℃培养3 d；待长出菌落后，挑取菌落大、生长快的菌落接种到PDA斜面保藏培养基中，28 ℃培养7 d，4 ℃保藏备用。

1.2.3 脂肪酸脱氢酶活性测定—TTC法筛选

新鲜菌体过滤收集后用蒸馏水洗涤两遍，取1 g菌体置于具塞试管中，加入2 mL质量浓度为8 g/L TTC溶液，Tris-HCl(pH8.4) 2 mL，35 ℃于暗处放置1 h。菌体用蒸馏水洗涤两遍后研磨成匀浆，用6 mL氯仿室温提取TF，取氯仿层，用分光光度计在485 nm波长下测定染色程度[14]。

1.3 生物量测定与油脂的提取

生物量测定：将一定体积(V)发酵液过滤后用蒸馏水洗涤两遍，得到湿菌体;然后置于电热鼓风干燥箱内，于70 ℃下烘干至恒质量，测得干菌体的质量(W)。

生物量(g/L)：W0=W/V。

油脂的提取：将干菌体碾碎后称取1 g，加入4 mol/L的盐酸10 mL，振荡混匀；室温放置30 min后，沸水浴5 min；-20 ℃速冷20 min左右，加入氯仿-甲醇(v/v=1∶1)混合液20 mL，充分振荡后，4 000 r/min离心20 min；弃上清，加入质量浓度为1 g/L NaCl溶液20 mL，混匀，4 000 r/min离心；弃上清，氯仿挥发后得到油脂，称量所得油脂的质量(W1)[15-16]。

产油量(g/L)：W2=W1×W0。

含油量：C=(W2/W0)×100%。

1.4 油脂脂肪酸成分分析

1.4.1 油样预处理

取0.2 g油脂样品置于具塞试管中，加入石油醚-乙醚(v/v= 4∶3)混合溶剂5 mL，振荡溶解;再加入物质的量浓度为0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液4 mL，振荡1 min;放置10 min后加入1 mL蒸馏水，静置30 min待其分层，取上清液进样[17]。

1.4.2 气象色谱条件

选用美国安捷伦7890A气象色谱仪，Agilent HP-519091J-413(30 mm×0.32 mm×0.25 μm)气相色谱柱；氢火焰离子化(FID)检测器。载气为高纯氮气，气体模式为恒流模式，流量为1 mL/min，尾吹气(氮气)流量为30 mL/min；H2流量为30 mL/min，空气流量为400 mL/min。进样量为0.5 μL，分流比(v/v)为50∶1。进样口温度为250 ℃，检测器温度为260 ℃。柱温采用三级程序升温：初温100 ℃，保持2 min；然后以17 ℃/min升温至200 ℃，保持4.7 min；再以40 ℃/min升温至240 ℃，保持15 min。

2 结果与分析

2.1 低能离子修饰技术对菌株的影响

低能离子束诱变有着特殊的作用过程和效应，其先后经历物理、化学和生物学3个阶段，最终引发终点生物学效应[18]。低能离子注入技术具有突变率高和突变谱宽的特点，不同能量和不同剂量的离子束作用于微生物细胞有着不同的效应，深黄被孢霉的存活率与氮离子的能量和剂量的关系如表1所示。

表1 存活率与氮离子能量和剂量之间的关系

突变率的高低与诱变的存活率密切相关，一般当菌种诱变的存活率为20%～30%时，突变率最高。表1中，当氮离子的能量为15 keV时，存活率均在20%以下；当氮离子的能量为10 keV时，存活率在10%～30%;而当氮离子诱变剂量为1.56×1015cm-2时,深黄被孢霉的存活率为26.3%。所以试验选用10 keV，离子剂量为1.56×1015cm-2的氮离子作为诱变处理的诱变剂。

2.2 油脂高产菌株的筛选

微生物诱变选育是一种繁琐而复杂的过程，往往耗费大量的精力也筛选不到理想的菌株。为了提高筛选效率，本文对诱变后菌株首先在平板上进行马来酰肼筛选，除去大量的负突变及未突变菌株。脂肪酸脱氢酶是合成GLA的关键酶，在发酵后采用TTC法测定菌种的脂肪酸脱氢酶的活性，进一步去除脂肪酸脱氢酶活性不强、GLA生产能力弱的菌种，留下GLA生产能力强的菌种。

2.2.1 马来酰肼抗性筛选

GLA是由一系列脂肪酸脱氢酶催化油酸、亚油酸等脂肪酸脱饱和而生成的，而脂肪酸脱氢酶的活性会受到马来酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活动所必需的GLA[19]。不同浓度的马来酰肼对出发菌株生长的抑制效果不同。表2为马来酰肼添加量与出发菌株深黄被孢霉As3.3410存活率及菌落直径的关系。从表2可以看出：当马来酰肼添加量小于40 mg/L时，深黄被孢霉的菌落存活率无显著变化，菌落直径随添加量的增加而减小；当添加量大于40 mg/L时，几乎不形成菌落，抑制率几乎达到100%。因此，选择40 mg/L的马来酰肼作为筛选剂加入平板培养基中，初步淘汰脂肪酸脱氢酶酶活低或GLA产量低、不足以维持菌株正常生长的突变株，使平板上只有正突变的菌株得以生长，缩小后期筛选的范围，提高筛选效率。

表2 马来酰肼添加量与出发菌株深黄被孢霉As3.3410存活率及菌落直径的关系

2.2.2 TTC法测定脂肪酸脱氢酶活性

红四氮唑(TTC)法广泛用于植物细胞及细菌的活力测定。脂肪酸脱氢酶是深黄被孢霉中合成GLA的关键酶，其活力的大小可间接表示细胞合成GLA能力的强弱。将TTC法用于深黄被孢霉菌丝体染色，以染色程度表示细胞内脂肪酸脱氢酶的活性[20]。通过对TTC法染色条件pH、温度及TTC浓度的优化，来确定最佳染色条件，结果如图1所示，其中，OD485为样品在485 nm时的吸光度值。从图1a中可以看出：随着TTC浓度的增加，菌丝体的染色程度逐渐加深；在TTC浓度为8 g/L时菌丝体染色程度最深，随后又有所下降。从图1b中可以看出：Tris-HCL缓冲溶液pH在8.4之前，随着pH的升高，菌丝体染色萃取液的吸光度在增加；当Tris-HCL缓冲溶液的pH为8.4时，菌丝体染色程度最深；当pH大于8.4时，吸光度又呈现下降趋势。由此可知,脂肪酸脱氢酶的酶活测定的最适pH值为8.4。从图1c中可以看出：反应温度低于35 ℃时，随着反应温度的升高，吸光度值逐渐变大；当反应温度高于35 ℃时，吸光度值又呈现下降的趋势。以此得出脂肪酸脱氢酶的最适反应温度为35 ℃。确定脂肪酸脱氢酶酶活测定的最佳条件为：TTC溶液的浓度为8 g/L，最适pH为8.4，最适温度为35 ℃，反应时间为1 h。

图1 TTC浓度、pH、温度对脂肪酸脱氢酶活性的影响

2.3 诱变筛选结果

经过反复的诱变→马来酰肼平板抗性筛选→发酵第4天的脂肪酸脱氢酶酶活测定筛选，获得5株高产菌株，其GLA产量及脂肪酸脱氢酶酶活(OD485)如表3所示。表3中，脂肪酸脱氢酶酶活从小到大依次为：As3.3410

表3 突变株与出发菌株比较表

注:菌种As3.3410为原始出发菌株，F208、F217、F369、F338、F312为经过反复诱变所获得的高产菌株。

图2 发酵过程As3.3410与F312主要参数比较

2.4 发酵特性

本文对高产菌株的发酵特性进行了初步研究(见图2)。从图2可以看出：F312及出发菌株As3.3410发酵过程中第3天到第8天的脂肪酸脱氢酶酶活的变化及GLA产量的变化。从第3天到第7天脂肪酸脱氢酶酶活随着时间的增加呈现上升的趋势；而到第8天有所下降，但整个发酵周期中突变株F312的脂肪酸脱氢酶酶活始终比出发菌株As3.3410的高。GLA产量随发酵时间的增加而增长，在脂肪酸脱氢酶酶活较高时，GLA的生产速率加快，在第7天时趋于稳定。通过用气相色谱对出发菌株及高产菌株成分进行分析(见图3)，可知突变株F312的GLA产量较出发菌株深黄被孢霉As3.3410的GLA产量有大幅度提高。

图3 GLA气相色谱图

3 结论

通过离子束诱变及抗性筛选的研究，找出了获得高产GLA深黄被孢霉的诱变筛选体系，该诱变筛选体系快速高效，可以对诱变后的突变株进行定向筛选，最终获得了一株高产突变株F312。试验结果如下：(1)采用10 keV的氮离子(N+)进行诱变，最佳离子束诱变剂量为1.56×1015cm-2。(2) 马来酰肼的最佳筛选质量浓度为40 mg/L；TTC法酶活测定的条件为：温度35 ℃、pH8.4、TTC质量浓度8 g/L、反应时间1 h。(3) 通过反复的诱变筛选，最终筛选出一株遗传性稳定的高产突变株F312，GLA产量达到1 236 mg/L，比出发菌株(480 mg/L)提高了157.5%。突变株F312发酵过程中脂肪酸脱氢酶活性和GLA产量均比出发菌株高，具有一定的商业研究价值，实验室将进一步进行小罐发酵，挖掘其商业生产价值。

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国家自然科学基金项目(U1304307);河南科技大学大学生研究训练计划基金项目(2014121)

刘胜男(1991-),女,河南周口人,硕士生;李市场(1978-),男,河南洛阳人,副教授,博士,硕士生导师,主要研究方向为微生物育种.

2014-11-12

1672-6871(2015)03-0076-05

Q93

A