响应面法优化灰兜巴多肽脱色工艺

李 锦,许 伟,邵 荣,颜秀花,韦 萍

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 210009;2.盐城工学院化学与生物工程学院,江苏盐城 224051)

响应面法优化灰兜巴多肽脱色工艺

李 锦1,2,许 伟2,邵 荣2,颜秀花2,韦 萍1,*

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 210009;2.盐城工学院化学与生物工程学院,江苏盐城 224051)

本文以灰兜巴蛋白的酶解液为原料,首次采用粉末活性炭对多肽液进行脱色处理,去除灰兜巴多肽液中的色素,以利于生物活性多肽的分离纯化。在单因素实验的基础上,用响应曲面法优化灰兜巴酶解液的脱色工艺。实验结果表明脱色剂为粉末活性炭时脱色效果最佳,其工艺参数为:pH3.3、活性炭用量1.6%、温度44℃、时间53min。在此条件下,灰兜巴蛋白酶解液的脱色率为73.12%,肽回收率为82.49%,与理论值相接近。该脱色工艺简单可靠,脱色效果好,且最大限度的保留了灰兜巴蛋白酶解液中的多肽含量,为开发灰兜巴多肽提供理论基础。

灰兜巴多肽,粉末活性炭,脱色,响应曲面法

灰兜巴是一种在海拔1500米以上的峨眉山深处老茶树林中以红蜘蛛吐的丝筑成的巢穴。它建成的巢穴外形像一个灰色的布袋,因此又称之为闭口袋[1-2]。伍艳[3]等人发现灰兜巴中含有蛋白质等生物活性物质。但是随着生物技术和营养学的发展,发现分子量介于蛋白质和氨基酸之间的多肽具有很强的生物活性,具有优良的营养价值、生理特性,更利于人体的消化吸收[4]。生物活性多肽是由多个氨基酸通过肽键链接而成的[5]。灰兜巴多肽是灰兜巴蛋白经过酶解、灭活、提纯、浓缩等工艺得到的小分子多肽混合物。前期研究发现,灰兜巴多肽液,即灰兜巴蛋白酶解液,原色为棕黄色或褐色,里面可能含有多肽、色素、糖类等物质,如果作为药物或者食品添加剂,其色泽不易被人们接受且色素颜色可能会带来不利的影响,也不利于后续的分离纯化。目前,能对多肽液进行有效脱色的脱色剂有:复合吸附剂[6]、大孔树脂[7]、强碱性阴离子树脂[8]、粉末活性炭[9]、颗粒状活性[10]等。其中粉末活性炭价格便宜,吸附速度快且具有良好的吸附性能,化学性能稳定,可以耐强酸、强碱、高温等,比表面积大,可以达到1000～1500m2/g,属于多孔性的疏水性吸附剂,其特有的多孔结构对吸附色素具有一定的饱和度[11],常用于脱色、除臭、除味等方面[12]。关晴[13]等人在黄豆酱多肽原液脱色及抗氧化活性研究中,用粉末活性炭对其进行脱色,其脱色率为59.85%,多肽的存留率为66.35%。本文采用四种不同的脱色剂对灰兜巴蛋白的酶解液进行脱色处理,以脱色率和多肽的回收率作为考察指标,选择适合灰兜巴酶解液的脱色剂,考察该脱色剂对灰兜巴多肽液的脱色影响,并运用响应面法对脱色工艺进行优化,为灰兜巴多肽的分离纯化、生物活性的鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灰兜巴 成都张坤成中药材行;灰兜巴蛋白酶解液 实验室自制(灰兜巴粗蛋白经复合蛋白酶酶解所得到的溶液);复合蛋白酶(活力≥120U/mg) 上海源叶生物科技有限公司;五水硫酸铜(AR)上海中试化工总公司;粉末活性炭、颗粒活性炭 上海源叶生物科技有限公司;硅藻土 吉林省临江市大华硅藻土产品有限公司;浓硫酸、氢氧化钠(AR)、双氧水(30%) 江苏彤晟化学试剂有限公司;去离子水 实验室自制。

津腾T-50溶剂过滤器 天津市津腾实验设备有限公司;RE-2000B 旋转蒸发器 上海雅荣生化设备仪器有限公司;752紫外可见分光光度计 上海佑科仪器有限公司;AUY220电子天平 日本岛津公司;TGLL-18K高速冷冻离心机 太仓市华美生化仪器厂;冷冻干燥机 北京博医康实验设备有限公司;恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 灰兜巴蛋白在时间3.50h,温度40℃,pH6.7,加酶量5300U/g,底物浓度为6%的条件下用复合蛋白酶进行酶解反应→酶解液经0.45μm的微滤膜微滤除菌预处理→脱色→过滤→离心(10000r/min,4℃,10 min)→检测上清液

1.2.2 脱色率 灰兜巴多肽液的颜色为棕黄色或褐色,在波长200～800nm下进行全波长扫描,确定其最大吸收峰的波长,然后在此波长下测定多肽液脱色前后的吸光度值,脱色率按下式计算[9]:

式中:A1为脱色前溶液的吸光度值;A2为脱色后溶液的吸光度值。

1.2.3 多肽回收率

1.2.3.1 标准曲线的绘制 标准曲线参考文献[14]中的方法并略作修改,以牛血清标准蛋白浓度为横坐标,540nm的OD值为纵坐标,制作标准曲线。

1.2.3.2 回收率的测定 将脱色前后的多肽液,与双缩脲反应,在540nm处测定OD值,代入标准曲线,计算多肽含量,多肽回收率按下式计算[9]:

式中:B1为脱色前溶液中多肽的含量;B2为脱色后溶液多肽的含量。

1.2.4 脱色剂的选择 考察粉末活性炭、颗粒活性炭、硅藻土和双氧水这四种脱色剂对灰兜巴酶解液的脱色效果,在相同的条件下对灰兜巴酶解液进行脱色处理,以脱色率和多肽回收率作为参考指标,选择出用于灰兜巴酶解液的最优脱色剂。每种脱色剂分别做3次平行实验,取平均值。

1.2.5 单因素实验 取一定量的灰兜巴酶解液,分别研究不同的pH、活性炭用量、温度和时间对脱色率和多肽回收率的影响。脱色的初始条件为pH7.0、活性炭用量4%、温度50℃和时间60min。各单因素水平为:pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;活性炭用量1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%;温度30、35、40、45、50、60、70℃;时间30、40、50、60、70min。

1.2.6 响应面法优化实验设计 参照文献[15-17]的方法,根据单因素实验的结果,采用Box-Behnken实验设计对灰兜巴蛋白酶解液的脱色进行4因素3水平的研究,见表1,每个处理平行测定3次,取平均值,以得到最优的脱色条件。

表1 响应面因素设计水平表Table 1 Factors and level value of response surface methodology

1.2.7 数据统计分析 采用Design Expert 8.0对响应面数据进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 全波长扫描图

由图1可知,灰兜巴多肽液在波长200～800nm下进行全波长扫描,在波长367nm处有最大吸收峰,因此选367nm作为测定波长。

图1 灰兜巴多肽液的吸收光谱曲线Fig.1 Absorption spectra curve of Huidouba polypeptide

2.2 脱色剂的选择

在用脱色剂对灰兜巴酶解液进行脱色时,偶有难闻的刺激性气味产生,这可能是因为酶解液中游离的氨基酸与脱色剂发生脱羧的反应,释放出胺类物质,而含有S元素的氨基酸如蛋氨酸和半胱氨酸还会释放出H2S[18]。由图2可知,采用粉末活性炭、颗粒活性炭、硅藻土和双氧水这四种脱色剂处理灰兜巴酶解液,在pH、温度和时间相同的脱色条件下,以粉末活性炭为脱色剂时脱色率是最高的,颗粒活性炭为脱色剂时的多肽回收率是最高的,综合脱色率和肽回收率两方面因素的考虑,本文选用粉末活性炭作为灰兜巴酶解液的脱色剂。

图2 不同脱色剂对脱色率和肽回收率的影响Fig.2 Effect of different bleaching agents on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3 单因素实验结果

2.3.1 pH对脱色效果的影响 由图3可知,脱色率随着pH的增大而增大(pH3除外),在酸性条件下,活性炭吸附色素的效果差。肽回收率随着pH的增大而逐步降低(pH2除外),并且在碱性条件下,多肽的回收率很低。在pH为2时,产生很多的沉淀,可能在此pH下,是部分肽的等电点,这与关晴等人[13]在对黄豆酱多肽原液脱色及抗氧化活性研究中,在pH为4时,大部分肽达到等电点沉淀相类似。综合脱色率和肽回收率两方面因素的考虑,pH定为3,这与周利亘[19]等人在对大豆多肽脱色工艺优化研究中,粉末活性炭最佳脱色pH3相同。

图3 pH对脱色率和肽回收率的影响Fig.3 Effect of pH on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3.2 活性炭用量对脱色效果的影响 由图4可知,活性炭用量对灰兜巴酶解的脱色效果影响显著。当活性炭用量在1%～4%的范围内,随着活性炭用量的增加,脱色率增加,但肽回收率却逐步减小,可能是因为随着粉末活性炭用量的增加,比表面积增大,活性炭对肽的吸附能力增强,导致肽回收率呈减小趋势。综合脱色率和肽回收率两方面因素的考虑,粉末活性炭用量定为1.5%,这与魏连会[9]等人在响应面法优化酱油中多肽的脱色工艺中,粉末活性炭最佳脱色活性炭用量1.5%相同。

图4 活性炭用量对脱色率和肽回收率的影响Fig.4 Effect of activated carbon concentration on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3.3 温度对脱色效果的影响 由图5可知,随着脱色温度的升高,灰兜巴酶解液的脱色率呈现升高的趋势,但肽回收率却呈现降低的趋势,这可能是活性炭脱色是一个吸热的过程,当温度升高时液体黏度降低,加快了溶液中色素分子和多肽的扩散速度,使得色素分子和多肽更容易进入到粉末活性炭的孔径,从而增加了灰兜巴酶解液与活性炭接触机会,更利于活性炭的吸附,增强脱色效果,同时也增强了对多肽的吸附[20-22]。综合脱色率和肽回收率两方面因素的考虑,脱色的温度定为45℃,这与黄敏[23]在对玉米醒酒肽产品研制及其功效研究中,粉末活性炭最佳脱色温度45℃相同。

图5 温度对脱色率和肽回收率的影响Fig.5 Effect of temperature on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3.4 时间对脱色效果的影响 由图6可知,随着脱色时间的延长,灰兜巴酶解液的脱色率先呈现升高的趋势后趋于平缓,但肽回收率却呈现降低的趋势,这可能是因为在活性炭吸附过程中,色素与活性炭需要一定的接触时间来提高脱色率[13],因此随着时间的延长,活性炭对多肽和色素的吸附量会增加,刚开始色素与肽竞争吸附,活性炭对色素吸附较强,当达到50min时色素吸附接近饱和,脱色率几乎不再变化,但对多肽的吸附量增加,从而导致肽回收率突然降低。综合脱色率和肽回收率两方面因素的考虑,脱色的时间定为50min,这与戴丽君[24]在正交实验优化大豆多肽脱色工艺中,粉末活性炭最佳脱色时间50min相同。

图6 时间对脱色率和肽回收率的影响Fig.6 Effect of time on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.4 响应面优化灰兜巴酶解液的脱色工艺条件

2.4.1 响应面优化实验的结果 以pH、活性炭用量、温度和时间为因素进行响应面优化灰兜巴多肽液的脱色工艺条件,分析见表2和表3。

由表3可知,该模型Y1和Y2差异极其显著(p值<0.0001),Y1和Y2决定系数R2值为0.9945和0.9983,表明灰兜巴蛋白酶解液的脱色率和多肽回收率的实验值和拟合值之间具有很好的拟合度。模型的失拟项p值>0.10,表明Y1和Y2二次模型是合适的。

表2 响应面实验结果Table 2 Results of response surface experiment

通过对模型系数的显著性分析可以得知:

Y1的X2、X3、X4、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42对灰兜巴蛋白酶解液的脱色率影响是显著的,其中因素X2、X4、X2X4、X22、X32、X42对脱色率的影响是极其显著的。一次项中各因素对灰兜巴蛋白酶解液的脱色率的影响显著性大小顺序是活性炭用量(X2)和时间(X4)>温度(X3)>pH(X1)。

经过拟合后可以建立关于pH、活性炭用量、温度以及时间的二次多项式回归模型为:

Y1(%)=72.27+0.13X1+4.35X2+0.40X3+2.00X4+0.38X1X2-0.93X1X3+0.063X1X4+0.70X2X3-1.44X2X4+0.85X3X4-0.67X12-3.14X22-0.923X2-1.94X42

Y2的X1、X2、X3、X4、X1X3、X2X3、X3X4、X12、X22、X32、X42对灰兜巴蛋白酶解液的肽回收率影响是显著的,其中因素X1、X2、X3、X4、X1X3、X3X4、X12、X22、X32对肽回收率的影响是极其显著的。

经过拟合后可以建立关于pH、活性炭用量、温度以及时间的二次多项式回归模型为:

Y2(%)=82.34+7.44X1-4.47X2-3.99X3-1.27X4-0.40X1X2-2.11X1X3+0.38X1X4+0.85X2X3-0.24X2X4-1.79X3X4-16.06X12-3.27X22-7.26X32-0.67X42

2.4.2 双因素间交互作用影响 由表3可知,Y1模型中pH与温度(图7a)、活性炭用量与温度(图7b)、活性炭用量与时间(图7c)、温度与时间(图7d)的两因素间的交互作用对灰兜巴蛋白酶解液的脱色率影响显著,见图7。

表3 回归模型的方差Table 3 Variance analysis of regression model

图7 脱色率响应曲面图Fig.7 The response surface plot of time and pH on the enzymolysis reaction

注:**,差异极显著(p<0.0001);*,差异显著(p<0.05),Y1-脱色率,Y2-肽回收率。

如图7所示,pH与温度的交互影响如图7a,其交互作用比较显著,在活性炭用量和时间处于最佳值,当温度不变的情况下,脱色率随着pH的增大而增大,但是增幅不是很明显。当pH处于不变的情况下,脱色率随着温度的升高而增大,但是增大不明显;活性炭用量与温度的交互影响如图7b,其交互作用显著,在pH和时间处于最佳值,当温度不变的情况下,脱色率随着活性炭用量的增加而提升,整体呈现先大幅度提升后趋于平缓。当活性炭用量处于不变的情况下,脱色率随着温度的增加而略微增大;活性炭用量与时间的交互影响如图7c,其交互作用极其显著,在pH和温度处于最佳值,当活性炭用量不变的情况下,脱色率随着时间的延长而增加。当时间不变的话,脱色率随着活性炭用量的增加而增加,并呈现先大幅度增大后趋于平缓。温度与时间的交互影响如图7d,其交互作用相当显著,在pH和活性肽用量处于最佳值,当温度在不变的情况下,脱色率随着时间的延长而增加。当时间处于不变的情况下,脱色率随着温度的升高而稍有增加。

由表3可知,Y2模型中pH与温度(图8a)、活性炭用量与温度(图8b)、温度与时间(图8c)的两因素间的交互作用对灰兜巴蛋白酶解液的肽回收率影响显著,见图8。

图8 肽回收率响应曲面图Fig.8 The response surface plot of time and pH on the enzymolysis reaction

如图8所示,pH与温度的交互影响如图8a,其交互作用极其显著,在活性炭用量和时间处于最佳值,当温度不变的情况下,肽回收率随着pH的增大,呈现先大幅度提升后降低的趋势。当pH处于不变的情况下,肽回收率随着温度的升高而增大,但是增大不明显;活性炭用量与温度的交互影响如图8b,其交互作用显著,在pH和时间处于最佳值,当温度不变的情况下,肽回收率随着活性炭用量的增加而降低。当活性炭用量处于不变的情况下,肽回收率随着温度的增加而略微增大;温度与时间的交互影响如图8c,其交互作用极其显著,在pH和活性炭用量处于最佳值,当温度不变的情况下,肽回收率随着时间的延长而略微降低。当时间不变的话,肽回收率随着温度的增加而减少,且温度越高降低的趋势越快。

2.4.3 灰兜巴蛋白酶解液脱色条件的确定及优化工艺条件验证 经Box-Behnken设计实验可以得到灰兜巴蛋白酶解液脱色的工艺条件为:pH3.25、活性炭用量1.61%、温度44.07℃、时间52.74 min。在此最优脱色条件下脱色率为73.27%,肽回收率为82.33%。

为了方便实际操作,将灰兜巴蛋白酶解液脱色的工艺条件设为:pH3.3、活性炭用量1.6%、温度44℃、时间53min。在此最优反应条件下进行验证实验,得到灰兜巴蛋白酶解液的脱色率为73.12%,肽回收率为82.49%,相对误差为0.20%和0.19%,实验证明该模型是适合有效的。

3 结论

以灰兜巴蛋白酶解液为原料,采用响应面法对灰兜巴蛋白酶解液的脱色工艺条件进行了优化,在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken方法设计建立数学模型,并进行了分析。结果表明,在本研究中,灰兜巴蛋白酶解液脱色效果最佳脱色剂为粉末活性炭。在影响灰兜巴酶解液脱色效果的四个因素中活性炭用量、时间和温度对脱色率和肽回收率影响均显著,其中pH与温度、活性炭用量与温度、活性炭用量与时间、温度与时间之间的交互作用是显著的;在对肽回收率的影响中,四个因素对其影响都是极其显著的,其中pH与温度、活性炭用量与温度、温度与时间之间的交互作用是显著的。灰兜巴蛋白酶解液的最优脱色条件为:pH3.3、活性炭用量1.6%、温度44℃、时间53min。在此条件下,理论脱色率是73.27%,肽回收率是82.33%,通过验证实际灰兜巴蛋白酶解液的脱色率为73.12%,肽回收率为82.49%,相对误差为0.20%和0.19%,证明该模型是适合有效的。本论文在用粉末活性炭脱色的同时,最大限度的保留了灰兜巴蛋白酶解液中的多肽含量,此法是灰兜巴蛋白酶解液脱色处理的一种简便有效的方法,为开发灰兜巴多肽提供理论基础。

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Optimization of the condition of decoloring process ofHuidouba polypeptide by response surface methodology

LI Jin1,2,XU Wei2,SHAO Rong2,YAN Xiu-hua2,WEI Ping1,*

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China;2.School of Chemical and Biological Engineering,Yancheng Institute of Technology,Yancheng 224051,China)

Huidouba polypeptide from Huidouba protease hydrolyzate had been decolored by activated carbon powder. It was helpful to separate and purify the bioactive peptides by removing the pigment from Huidouba polypeptide hydrolyzate. Based on the results of single factor experiments,the decoloring process was optimized by response surface methodology. Activated carbon powder was the best as a bleaching agent and the optimal conditions were as follows:pH3.3,The amount of activated carbon 1.6%,temperature 44℃,time 53min. Under the optimal conditions,the decoloring rate was 73.12%,and the peptide retention rate was 82.49% which were close to theoretical value. The decoloring process was cost-effective,simple,reliable,and maximized the retention of Huidouba protease hydrolyzate with high peptide retention rate. The results would provide a theoretical foundation for the development of Huidouba polypeptide.

Huidouba polypeptide;powdered activated carbon;decolorization;response surface methodology

2014-10-08

李锦(1988-)，男，硕士研究生，主要从事生物资源综合利用研究。

*通讯作者:韦萍(1961-)，女，博士，教授，研究方向：生化工程。

国家自然科学基金(31101912)；江苏省自然科学基金(BK2011420)；江苏省“青蓝工程”项目；江苏省博后基金项目(1401101C)；江苏省大学生实践创新训练省指导项目(2014046)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)13-0199-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.033