不同缺血后处理方案对家兔挤压综合征损伤保护效应的实验研究

王金墙，刘子泉，丁 辉，樊毫军，董文龙，宋美娟，侯世科

·论著|ORIGINAL ARTICLES·

不同缺血后处理方案对家兔挤压综合征损伤保护效应的实验研究

王金墙1，刘子泉2，丁 辉2，樊毫军2，董文龙2，宋美娟2，侯世科2

目的 筛选不同缺血后处理(ischemic postconditioning，IPost)方案对家兔挤压综合征(crush syndrome，CS)损伤保护效应的最佳时间窗。方法 选取48只家兔随机分为对照组(S组)及5个不同IPost方案组(IPA～IPE组)，每组8只。建立CS模型，并于解压前游离双下肢股动、静脉，解压后IPA组给予阻断下肢血流5 s，再灌注5 s，共5个循环(即5×5 s/5 s)，IPB组5×30 s/30 s，IPC组5×1 min/1 min，IPD组5×5 min/5 min，IPE组3×10 min/10 min，继续观察至解压后24 h。分别于建模前，解压即刻及解压后2、6、12、18、24 h时间点检测家兔血液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌红蛋白(myoglobin，Mb)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的含量。结果 与S组相比，各IPost组均可降低解压后CS家兔血清CK、Mb和NGAL的含量。在解压后6、12、18、24 h，IPC、IPD组各指标与S组相比，差异均具有统计学意义(P<0.005)；IPC组各指标较 IPD组低，但解压后各时间点两组之间比较无显著差异。结论 CS家兔再灌注前给予1～5 min的肢体远隔IPost对损伤具有保护作用，其中给予5个循环的1 min缺血，1 min再灌后处理具有最佳保护效应。

挤压综合征；缺血后处理；肌酸激酶；肌红蛋白；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

CS指四肢或躯干肌肉丰富的部位，遭受重物长时间挤压，在解除压迫后出现的以肢体肿胀、肌红蛋白尿、高血钾为特点的急性肾功能损伤，是地震伤亡中仅次于直接创伤以外的第二致死原因[1, 2]。尽管灾后发生率仅为8%左右，但因其所导致的死亡却占总病死率的40%～60%[3]。近年来，我国地震灾害频发，CS的发病率也呈现逐渐增加的趋势[4]，对社会的安定和经济的发展造成了重大影响。关于CS的救治，除快速大量补液、碱化尿液、渗透性利尿和防治高血钾等措施外，应尽早行血液净化治疗[5]，然而多次救援实践表明，CS患者最早接受血液净化治疗的时间多为震后8 h[4]。因此从解除压迫至血液净化治疗的这段时间，能否通过其他有效治疗手段来减轻或延迟CS所导致的机体损伤？有研究表明IPost在心脏、肾脏、大脑等缺血损伤具有一定的保护作用。目前鲜有关于应用IPost治疗CS患者的报道，本研究拟通过动物实验筛选不同IPost方案对家兔CS损伤保护作用的最佳时间窗。

1 材料与方法

1.1 材料 48只健康成年日本大耳白兔，6～12月龄，体重(2.3±0.2)kg，购自军事医学科学院动物实验中心[许可证号：SCXK(军)2012-0002]。于实验前适应性饲养3 d，单只分笼喂养，保持室温22～26 ℃，湿度60%～65%，自由摄食和饮水，实验前12 h禁食，正常供水。

1.2 模型建立 参考文献[6, 7]的造模方法，并结合前期预实验情况建立家兔CS模型。1%的戊巴比妥钠3 ml/kg耳缘静脉麻醉后，使用自动气压止血带(威海市博华医疗设备有限公司)给予家兔单下肢100 kPa挤压8 h，解压前游离双下肢腹股沟处股动、静脉。

1.3 实验分组及方法 48只家兔随机分为6组，每组8只，分别为对照组( S组)，挤压建模8 h后，不做任何处理。后处理A组(IPA组)，解压后立即使用动脉夹夹闭动、静脉5 s，再灌注5 s，循环5次，标记为5×5 s/5 s。同样，后处理B组(IPB组)，标记为5×30 s/30 s。后处理C组(IPC组)，标记为5×1 min/1 min。后处理D组(IPD组)，标记为5×5 min/5 min。后处理E组(IPE组)，标记为3×10 min/10 min。所有分组在解压1 h后缝合双下肢切口，继续观察24 h。

1.4 标本处理和检测 分别在建模前，解压即刻及解压后2、6、12、18、24 h时间点，通过耳中动脉留置针抽取2 ml血液，4℃保存1 h后，离心(3000 r/min，15 min)取其上清液，应用全自动生化分析仪检测CK的含量，采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)Mb、NGAL的含量，具体操作按照说明书进行。

2 结 果

2.1 一般情况 各组家兔在挤压建模的过程中均未出现死亡，解压后均表现为精神萎靡，呼吸急促，四肢冰冷，受压肢体均不能正常活动，肿胀明显，远端肢体呈淤血表现。解压2 h后各组均出现尿量减少，颜色加深，甚至出现棕红色尿，解压18 h后均为无尿状况。

2.2 血清CK含量变化 解压时各组血清CK的含量可升高至挤压前的近10倍，并继续升高。不同方案组内解压后各时间点与建模前及解压即刻相比分别具有统计学意义(P<0.008)。各时间点不同分组间两两比较显示：在建模前及解压即刻两个时间点，各组之间比较均无统计学意义(P>0.005)；在解压后2、6、12、18、24 h时间点，IPC组与S组相比差异均有统计学意义(P<0.005)；在解压后6、12、18、24 h时间点，IPB、IPD组与S组相比，差异均有统计学意义(P<0.005)；其余各时间点各组与S组相比均无统计学意义；在解压后12、18、24 h时间点，IPC组与IPA组相比，差异均有统计学意义(P<0.005)；在解压后18、24 h时间点，IPD组与IPA组相比，IPC组与IPB组相比，差异均有统计学意义(P<0.005)；在解压后6、12、18、24 h时间点，IPE组与IPB、IPC、IPD组相比均有统计学意义(P<0.005)；其余各时间点各组间差异均无统计学意义。见表1。

2.3 血清Mb含量变化 不同方案组解压后各时间点血清Mb含量与建模前及解压即刻相比均具有统计学意义(P<0.008)。各时间点不同分组间两两比较结果示：在建模前及解压即刻两个时间点，各组之间相比均无统计学意义(P>0.005)；在解压后2、6、12、18、24 h时间点，IPB、IPC、IPD组与S组相比差异均有统计学意义(P<0.005)，IPA、IPE组与S组相比均无统计学意义；在解压后2、6、12、18、24 h时间点，IPC、IPD组与IPA组相比，IPE组与IPC、IPD组相比，差异均有统计学意义(P<0.005)；在解压后6、12、18、24 h时间点，IPC、IPD组与IPB组相比，差异均有统计学意义(P<0.005)；其余各时间点各组间差异均无统计学意义。见表2。

2.4 血清NGAL含量变化 不同方案组解压后各时间点血清NGAL含量与建模前及解压即刻相比均具有统计学意义(P<0.008)。各时间点不同分组间两两比较结果显示：在建模前及解压即刻两个时间点，各组之间相比较均无统计学意义；在解压后12、18 h时间点，IPA、IPB、IPE组与S组相比，差异有统计学意义(P<0.005)；在解压后2、6、12、18、24 h时间点，IPC、IPD组与S组相比，差异有统计学意义(P<0.005)；在解压后2、6、12、18 h时间点，IPC、IPD组与IPA组相比，IPC组与IPB组相比，IPE组与IPC、IPD组相比差异均有统计学意义(P<0.005)；其余各时间点各组间差异均无统计学意义。见表3。

表1 各组家兔血清CK含量随时间变化情况 (n=8；×103 U/L；

注： S组为对照组，IPA组为后处理5×5 s/5 s组，IPB组为5×30 s/30 s组，IPC组为5×1 min/1 min组，IPD组为5×5 min/5 min组，IPE组为3×10 min/10 min组；与S组比较，①P<0.005；与IPA组比较，②P<0.005；与IPB组相比，③P<0.005；与IPC组相比④P<0.005；与IPD组相比，⑤P<0.005

表2 各组家兔血清Mb含量随时间变化情况 (n=8；ng/ml；

注：S组为对照组，IPA组为后处理5×5 s/5 s组，IPB组为5×30 s/30 s组，IPC组为5×1 min/ 1min组，IPD组为5×5 min/5 min组，IPE组为3×10 min/10 min组；与S组比较，①P<0.005；与IPA组比较，②P<0.005；与IPB组相比，③P<0.005；与IPC组相比，④P<0.005；与IPD组相比，⑤P<0.005

表3 各组家兔血清NGAL含量随时间变化情况 (n=8；pg/ml；

注：S组为对照组，IPA为后处理5×5 s/5 s组，IPB为5×30 s/30 s组，IPC为5×1 min/1 min组，IPD为5×5 min/5 min组，IPE为3×10 min/10 min组；与S组比较，①P<0.005；与IPA组比较，②P<0.005；与IPB组相比，③P<0.005；与IPC组相比，④P<0.005；与IPD组相比，⑤P<0.005

3 讨 论

地震灾害中挤压伤多发生于四肢，因下肢肌肉组织丰富，故本研究以家兔下肢作为挤压位置。在挤压压力的选择上，根据国内外相关实验研究及灾害现场救援情况分析，通常导致患者挤压伤的重物重量多为患者体重的5～10倍，根据止血带的有效宽度3 cm计算，故选择100 kPa作为恒定挤压压力。文献[8]报道，肌肉组织受挤压2～4 h即可发生损伤，超过6 h可发生不可逆性损伤，随着挤压的时间延长，发生CS的可能性逐渐增高。同时多次救援实践案例调查发现，专业救援人员多在震后5～8 h到达灾害现场，部分研究实验选择震后8 h作为挤压综合征的造模时间[2]，综合前期预实验结果，本研究使用自动气压止血带给予家兔单下肢100 kPa压力8 h以建立家兔CS模型，解压后家兔下肢出现瘀斑，肿胀严重，尿量逐渐减少，甚至出现肌红蛋白尿及无尿。解剖发现，下肢挤压处肌肉颜色加深，组织间液明显增多。解压后各血液检测指标显著升高，说明家兔已发生横纹肌溶解并导致急性肾衰竭，证明CS建模成功。

IPost是指在组织、器官缺血恢复血供之前，给予短暂、数次的再灌注-缺血的处理过程，以有效改善组织器官发生缺血再灌注损伤。由 Zhao等[9]在2003年利用犬心肌梗死模型试验中发现，并首次提出了其概念。尽管IPost在心脏、肾脏、大脑等缺血损伤具有一定的保护作用，但不同的时间方案及循环次数产生的治疗效果也有所不同。李嵩山等[10]在孕兔失血性休克的实验研究中发现，给予双下肢股动脉缺血30 s/再灌注30 s，循环10次后，可以有效的减轻缺血再灌注对肾功能的损伤。Jiang等[11]在切除右肾建立的急性肾衰模型中发现分别给予6个循环的10 s、30 s、1 min的IPost均对肾移植具有炎性反应的保护作用，并且10 s组的缺血后处理效果最佳。Kerendi等[12]利用小鼠的心梗模型，对肾动脉实施单次5 min的远隔缺血后处理，可以显著减轻心肌缺血再灌注所导致的损伤。因此研究设计了5 s～10 min的IPost时间窗，进行不同的IPost方案对家兔CS损伤的保护作用的实验研究。

由于CK、Mb主要存在于骨骼肌和心肌等细胞中，当骨骼肌损伤时，其表达水平可迅速上升；NGAL是急性肾损伤的生物标志物之一，其表达的增加对CS的早期诊断和病情评估具有重要意义。因此，本研究主要以血液中CK、Mb和NGAL的含量作为最佳IPost时间窗的筛选指标。

本研究发现，建模前及解压即刻，各处理组各指标两两比较示差异均无统计学意义；在解压后6、12、18、24 h，IPC、IPD组血清CK、Mb和NGAL含量与S组相比差异均具有统计学意义；其中血清CK含量IPC、IPD组在解压后18、24 h与IPA组，解压后6、12、18、24 h与IPE组相比差异均显著；血清Mb含量IPC、IPD组在解压后2、6、12、18、24 h与IPA、IPE组，解压后6、12、18、24 h与IPB组相比差异均有统计学意义；血清NGAL含量IPC、IPD组在解压后2、6、12、18 h与IPA、IPE组相比差异均具有统计学意义。解压后各时间点IPC组各指标较 IPD组低，但两组之间比较均无显著差异。说明通过有创IPost可有效降低CS所致机体损伤，其中给予5个循环1 min缺血、1 min再灌注为效果最佳IPost方案。

综上所述，本研究利用自动气压止血带，建立了稳定的家兔CS模型，通过设置多组不同时间方案，筛选并得出结论：CS家兔再灌注前给予1～5 min的肢体远隔IPost对损伤具有保护作用，其中给予5个循环的1 min缺血，1 min再灌后处理具有最佳保护效应。IPost操作简单可行，应用前景广泛，具有重要临床价值。但是，关于IPost应用于CS的案例鲜有报道，且本研究为动物实验，因物种的差异，得出的结论在人类的临床治疗中是否同样显著，还需进一步验证。

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(2015-03-31收稿 2015-04-22修回)

(责任编辑 付 辉)

Experimental study on the protective effect of different ischemic postconditioning scheme in rabbits with crush syndrome

WANGJinqiang1，LIUZiquan2，DINGHui2，FANHaojun2，DONGWenlong2，SONGMeijuan2，andHOUShike2.

1.SpecialtyofEmergencyMedicine,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003,China; 2.InstituteofDisasterandEmergencyRescueMedicine,AffiliatedHospitalofLogisticsCollege,ChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,ChinaCorrespondingauthor:HOUShike,E-mail:houshike@126.com

Objective To screen the best time-window of the protective effect of different ischemia postconditioning (IPost) scheme on rabbits with crush syndrome (CS) injury. Methods 48 healthy Japanese white rabbits were selected and randomly divided into control group (S group) and 5 groups of different IPost scheme (IPA～IPE group), 8 rabbits each. CS model was established, and femoral arteries and veins were separated in the groin of both lower limbs before releasing of pressure. After decompression, the arteries of IPA group were treated with bulldog climp clamping for 5 s, then releasing 5 s, and repeated for 5 cycles (5×5 s/5 s), IPB group was 5×30 s/30 s, IPC group was 5×1 min/1 min, IPD group was 5×5 min/5 min, IPE group was 3×10 min/10 min, observation lasted 24 h after releasing of pressure. The concentration of serum creatine kinase (CK), myoglobin (Mb) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) were detected before establishment of CS model, immediateness after decompression and 2, 6, 12, 18 and 24 h after decompression. Results Compared with S group, the concentration of serum CK, Mb and NGAL were reduced in all Ipost groups after decompression. All indexes of groups of IPC and IPD in 6, 12, 18, 24 h after decompression was statistical significant in comparison with S group (P<0.005); All indexes of IPC group were lower than IPD group in each time point after decompression, but there was no significant difference. Conclusions Giving 1-5 min remote ischemia postconditioning for 5 cycles before reperfusion to rabbits with crush syndrome may produce effective protection to organism injuries; among these groups, IPC group (5×1 min/1 min) showed the most obvious effect.

crush syndrome; ischemic postconditioning; creatine kinase；myoglobin; neutrophil gelatinase-associated lipocalin

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.05.003

国家自然科学基金课题(71173232)；天津市重点支撑项目(12ZCZDSF00700)

王金墙，硕士研究生在读，E-mail: cnwangjq@126.com

1. 453003，河南省新乡医学院急救医学专业； 2. 300162 天津，武警后勤学院附属医院救援医学研究所

侯世科，E-mail: houshike@126.com

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