TGFβ1诱导的肝脏前体细胞上皮-间质转换在逆转过程中可影响星状细胞活化

赵文姗 杨爱婷 孙亚朦 贾继东 尤红

肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化是肝纤维化发生、发展的主要因素［1］。当慢性肝损伤时，肝细胞再生受到抑制，此时肝脏前体细胞(hepatic progenitor cells，HPC)可被激活，通过分化成肝细胞和胆管细胞对肝脏损伤产生应答并进行修复［2-3］。

Lorizini等［4］发现，在大鼠或小鼠肝脏受损模型和人类慢性乙型肝炎、丙型肝炎纤维化组织中，激活的HPC常与肝HSC伴行。经TGFβ1刺激后的HPC在与HSC利用Transwell间接共培养时，可影响HSC的活化。其中，TGFβ1在体外培养中可诱导HPC发生上皮-间 质 转 换 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)［5］。而用HPC的条件培养基培养HSC时，则不能活化HSC。因此，前体细胞是否只有在TGFβ1升高的情况下才会对HSC发挥作用，尚不清楚。

本研究使用大鼠肝脏WB-F344和HSC-T6细胞系作为HPC和HSC体外研究的模型，通过条件培养基体系，观察HPC经TGFβ1刺激后，其条件培养基对HSC活化及细胞外基质的影响。

材料和方法

一、主要材料

大鼠肝脏前体细胞系WB-F344由军事医学院裴雪涛教授赠送，大鼠肝星状细胞(T6)系由美国纽约西奈山医学院Friedman教授赠送。DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司。TGFβ1购自PeproTech公司(100-21C)。反转录PCR试剂盒购自美国Promega公司，SYBR Green实时荧光定量PCR试剂购自美国ABI公司。引物序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成。大鼠Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ)酶联免疫分析试剂盒(Rat0513)购自美国 Andy Gene公司。Western印迹所用的第一抗体详见表1，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物公司。

表1 Western印迹抗体及条件

二、方法

(一)条件培养基间接共培养体系的建立

前体细胞复苏后用含 10%FBS的 DMEM(含100 U/mL青霉素，100 μg/mL 链霉素)，于 37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。取对数生长期的前体细胞，消化后制备成单细胞悬液，根据需要以适当密度接种于100 mm细胞培养皿，培养24 h。待细胞贴壁后弃去旧培养基，换成TGFβ1浓度为10 ng/mL的10%FBS的 DMEM 培养基培养 6、12、24、36或48 h。弃掉含 TGFβ1培养基，PBS洗细胞一次，换含10%FBS的DMEM培养基继续培养48 h，收集上清液及细胞，提取细胞总蛋白，并以不加任何处理因素为对照组。

同取对数生长期的HSC细胞，以每皿5×105个接种于100 mm细胞培养皿，培养24 h。弃去旧培养基，换上述收集的条件培养基，继续培养48 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白及RNA。

(二)HSC及前体细胞总蛋白的提取及Western印迹

将上述收集的HSC及前体细胞，予以蛋白裂解液处理并制备蛋白样品，利用BCA蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量后，每组取30 μg总蛋白上样。12%SDS-PAGE分离蛋白质，湿转恒流390 mA 55 min，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭3 h，分别加入α-SMA及TIMP-1的一抗，4℃孵育过夜，充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(1∶8 000稀释)和山羊抗兔二抗(1∶10 000稀释)，室温孵育l h，充分洗涤后发光、显影、定影、曝光及扫描。内参对照β-actin用洗膜液于室温孵育40 min洗膜后重新封闭，加入β-actin一抗和相应二抗孵育。

(三)HSC-T6细胞总mRNA的提取及实时荧光定量PCR

按照Trizol Reagent试剂盒说明书的步骤提取细胞总mRNA，按照Promega公司反转录试剂盒说明书的步骤将4 μg mRNA 反转录，得到50 μL cDNA。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中相应指标的变化，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照。引物序列见表2。DNA序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成。实时荧光定量PCR反应条件:95℃ 10 min;94℃ 15 s，60℃ 60 s，循环40 次。

表2 实时PCR引物序列

(四)ELISA法检测条件培养基中Col-Ⅰ的含量

按照ELISA试剂盒说明书的步骤检测上述所收集的条件培养基中Col-Ⅰ的含量。经过加样、温育、配液、加酶、洗涤、显色及终止反应等步骤后，用酶标仪450 nm读数，测定各孔A值。以A值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据上清液的A值计算出其浓度。

六、统计学方法

采用SPSS 16.0软件行单因素方差分析，数据以均数±标准差表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、TGFβ1对肝脏前体细胞形态学的影响

利用 TGFβ1(10 ng/mL)刺激 HPC 6、12、24、36 及48 h，以新鲜培养基培养相应时间点的细胞作为对照组，倒置显微镜观察细胞形态的变化。结果TGFβ1刺激后细胞明显变大变圆，胞质比例明显增加，核质比减少。随着TGFβ1药物作用时间的增加，上述变化更为明显(见图1)。

二、去除TGFβ1刺激后，其诱导的EMT可逆转

用TGFβ1刺激前体细胞不同时间点后，弃掉上清液，换新鲜培养基再培养48 h(见图2A)。发现短期刺激后前体细胞表现为间质细胞特点，主要表现为间质细胞标志物α-SMA的表达升高，6 h及12 h分别为对照组的2.2 倍(P=0.01)及 2.62 倍(P=0.28);随着刺激超过24 h，与对照组相比，α-SMA的表达无明显变化，24、36及 48 h分别为对照组的 1.31倍(P ＞0.05)、0.97 倍(P=0.027)及 1.08 倍(P=0.058)。(见图 2B)。

三、条件培养基间接共培养未能改变HSC细胞形态

将培养过TGFβ1预刺激后的前体细胞48h的培养基收集、离心、过滤后作用于HSC，以培养过未经处理前体细胞的条件培养基作为对照组，使用普通倒置显微镜观察各组HSC细胞形态(见图3)。TGFβ1预刺激后的条件培养组的HSC细胞形态与对照组无差别，各组细胞呈梭形。

图1 TGFβ1作用于HPC不同时间点后，前体细胞形态学发生明显变化(倒置显微镜×10)

图2 去除TGFβ1刺激后，其诱导的前体细胞上皮-间充质转换可发生逆转

图3 TGFβ1刺激前体细胞后的条件培养基未能改变HSC细胞形态倒置显微镜(×10)

四、条件培养基对HSC细胞活化及细胞外基质的作用

与未经处理的WB-F344细胞条件培养基相比，TGFβ1刺激6h后的WB-F344细胞条件培养基能够促使HSC活化指标α-SMA和细胞外基质指标TIMP-1在蛋白水平表达升高;这两个指标在基因水平上也呈升高趋势，分别升高4.12倍(P=0.008)及 2.64倍(见图4A、4B)。然而，经TGFβ1刺激24 h后的条件培养基培养后上述作用相反，主要表现为:α-SMA的蛋白表达降低，而TIMP-1的表达无明显变化;α-SMA和TIMP-1基因水平变化分别为，24 h为对照组0.81 倍及0.98 倍，36 h为0.96 倍及0.61 倍，48 h为0.63倍及0.76倍(见图4B)，呈降低趋势。

图4 TGFβ1刺激前体细胞后的条件培养基，对HSC细胞活化及细胞外基质表达的变化

五、TGFβ1刺激前体细胞后的条件培养基中Col-Ⅰ的表达无显著变化

我们用酶联免疫分析试剂盒检测所收集的条件培养基中Col-Ⅰ的含量，结果显示，TGFβ1刺激后的前体细胞条件培养基中Col-Ⅰ的含量，与未经处理的条件培养基相比并无明显差异(P＞0.05)(见图5)。这说明，条件培养基对HSC活化及细胞外基质产生的作用可能与Col-Ⅰ的分泌无关。

图5 TGFβ1刺激WB-F344后的条件培养基中Col-Ⅰ的表达量并无明显变化

讨 论

慢性肝损伤时，HPC与HSC的密切联系使得人们越来越关注HPC能否通过调控HSC进而影响肝纤维的进展。本研究采用前体细胞体外模型WB-F344细胞株，其在不同诱导剂的作用下，能够分化为成熟的肝脏细胞和胆管上皮细胞［7］。

细胞共培养技术可模拟体内生成的微环境，便于更好的观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点。Lin等［8］发现通过Transwell小室共培养体系，人多能间充质干细胞分泌的神经生长因子可促进HSC的凋亡并抑制增殖，进而起到抗肝纤维化的作用。既往研究显示，经 TGFβ1刺激后的 HPC在与 HSC利用Transwell间接共培养时，可影响HSC的活化。TGFβ1是经典的致纤维化诱导剂，慢性肝损伤时可升高。

本研究发现，前体细胞在去除TGFβ1刺激后，其间质细胞标志物的表达可逐渐下降，这在一定程度上说明前体细胞EMT发生了逆转。这可能与所换的新鲜培养基中FBS有关，因为FBS中含有的EGF可能促进了这一过程［6］。在EMT的逆转过程中，其条件培养基又能够对HSC的活化发挥作用。当TGFβ1刺激前体细胞的时间相对较短，其条件培养基可促进HSC的活化;而当逐渐增加刺激时间时，条件培养基反过来会抑制HSC的活化。这可能与前体细胞的状态有关，前体细胞接受到外界损伤信号时，如果刺激轻微或时间较短，其并不能发挥损伤修复的作用，从而刺激HSC的活化;而当刺激足够强或时间长时，前体细胞才能启动损伤修复机制，进而抑制HSC的活化。本研究为进一步探讨HPC和HSC之间的相互作用以及治疗肝纤维化提供了一定的实验室基础，但前体细胞逆转过程中分泌的某种因子或通过某种基质作用于HSC仍需进一步研究。

1 Sprenger H，Kaufmann S，Garn H，et al.Induction of neutropilattracting chemokinesin transforming rathepatic stellate cells.Gastroenterology，1997，113:277-285.

2 Dan YY，Riehle KJ，Lazaro C，et al.Isolation of multipotent progenitor cells from human fetal liver capable of differentiating into liver and mesenchymal lineages.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:9912-9917.

3 Williams MJ，Clouston AD，Forbes SJ.Links between hepatic fibrosis，ductular reaction，and progenitor cell expansion.Gastroenterology，2014，146:349-356.

4 Lorenzini S， Bird TG， Boulter L， et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.Gut，2010，59:645-654.

5 Wang P，Liu T，Cong M，Wu X，Bai Y，Yin C，An W，et al.Expression of extracellular matrix genes in cultured hepatic oval cells:an origin of hepatic stellate cells through transforming growth factor beta Liver Int，2009，29:575-584.

6 Sam R，Wanna L，Gudehithlu KP，Garber SL，Dunea G，Arruda JA，Singh AK.Glomerular epithelial cells transform to myofibroblasts:early but not late removal of TGF-beta1 reverses transformation.Transl Res，2006，148:142-148.

7 Couchie D，Holic N，Chobert MN，et al.In vitro differentiation of WBF344 rat liver epithelial cells into the biliary lineage.Differentiation，2002，69:209-215.

8 Lin N，Hu K，Chen S，et al.Nerve growth factor-mediated paracrine regulation of hepatic stellate cells by multipotent mesenchymal stromal cells.Life Sci，2009，85:291-295.