微小RNA Let－7／Lin28调节环在鼻咽癌中的表达及意义

黄孝文， 饶丽华， 许 胜， 崔伟伟， 崔永华

华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 430030

微小RNA Let－7／Lin28调节环在鼻咽癌中的表达及意义

黄孝文， 饶丽华＃， 许 胜， 崔伟伟， 崔永华

华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 430030

目的 观察miRNA Let－7和Lin28在鼻咽癌组织中的相对表达并分析其相关性，探讨该调节环在鼻咽癌病理机制中的可能作用和意义。方法 以正常鼻咽组织为对照，运用实时定量聚合酶链反应（Real－time PCR）方法分别检查鼻咽癌组织中Lin28A／B和Let－7amiRNA的相对表达量，并对两组数据进行相关性分析。采用免疫组织化学技术检查Lin28A／B在鼻咽癌组织中的表达部位和水平。结果 Real－time PCR实验显示，Lin28miRNA在鼻咽癌组织中的相对表达量较对照组升高，而Let－7amiRNA在鼻咽癌组织的相对表达量较对照组降低，差异有统计学意义；鼻咽癌组织中Lin28A／B miRNA和Let－7amiRNA的相对表达量呈负相关。免疫组织化学分析证实，Lin28蛋白在鼻咽癌组织呈阳性表达，定位于细胞质中；而在正常鼻咽组织中，Lin28无表达。结论 在鼻咽癌组织中Lin28表达上调而Let－7amiRNA表达下调，且二者呈显著的负相关，提示Let－7／Lin28双向负反馈调节异常可能参与了鼻咽癌的发生发展。

鼻咽癌； Lin28； Let－7； 实时定量聚合酶链反应； 免疫组织化学

古老而高度保守的小分子RNA（miRNAs）Let－7家族，因其对干细胞分化、个体发育的调控以及对肿瘤的抑制功能而引起人们的高度重视。最近，人们发现，发育调节的关键因子、RNA结合蛋白Lin28可通过阻断Let－7生物合成而抑制Let－7表达［1］。研究显示，miRNA在肿瘤的发生发展和侵袭转移机制中有重要作用［2］。具有肿瘤抑制作用的miRNA Let－7家族在许多恶性肿瘤细胞中表达降低，而小分子RNA结合蛋白Lin28在恶性肿瘤中表达升高。miRNA Let－7和Lin28互为对方的靶基因，而表现为一对相互抑制和负向调控的因子，故在文献中它们又被称为“双向负反馈环或调节环”［1］。作者前期的研究发现，在散发的听神经瘤中，Let－7表达升高而Lin28表达降低［3］。然而，miRNA Let－7／Lin28双向负反馈环在其他肿瘤，例如鼻咽癌的表达尚未见报道。为进一步观察Let－7／Lin28在肿瘤组织中的表达及其意义，本研究观察了miRNA Let－7／Lin28在鼻咽癌中的表达，探讨了二者的相互关系及在鼻咽癌中的可能作用，以期为深入揭示miRNA与鼻咽癌发生发展的关系，进而为其分子靶向治疗策略的探索提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

从2012年9月初至2013年4月底在华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科门诊就诊的病例中，随机选取疑诊鼻咽肿瘤的患者36例。患者主诉包括颈部包块17例（47.2%），头痛9例（25%），耳鸣耳闭8例（22.2%），鼻塞7例（19.4%）；大多数病例的影像检查结果提示鼻咽新生物。另随机选取非咽喉病患者8例作为正常对照组。

1.2 病理标本

在患者知情并同意的情况下，对每一病例分别于局麻下实施内镜辅助鼻咽活检术。对所采集病理标本，取部分组织以多聚甲醛固定送临床病理学检查，剩余部分组织立即放入消毒的离心管，置入液氮中，进而保存于—80℃冰箱备用。

1.3 病理学检查及研究分组

对所有研究对象的鼻咽活检组织，进行临床病理学检测，根据最终诊断结果分组:36例疑癌患者中10例确诊为鼻咽慢性炎症，予以剔除；余26例确诊为不同角化和分化类型的鼻咽癌，为肿瘤组。非咽喉病患者8例，病理检查均排除鼻咽肿瘤和炎症，为对照组。肿瘤组26例中男20例，女6例，平均年龄42.9岁；对照组8例中男3例，女5例，平均年龄44.1岁。

1.4 实验方法

1.4.1 实时定量PCR（Real－time PCR）检测 对全部鼻咽组织标本进行Real－time PCR检测，主要步骤为:①将冷冻保存的活检组织捣碎，Trizol法抽提细胞的总RNA，利用紫外分光光度计测定λ260nm／λ280nm比值判断RNA纯度，以λ260nm光吸收定量，逆转录合成cDNA，以总cDNA为进一步的Real－time PCR模板。②分别设计靶基因Let－7amiRNA、内参照U6snRNA，以及Lin28A、Lin28B、GAPDH的上下游引物（引物序列见表1）。③Real－time PCR引物及模板验证:在进行Real－time PCR检测前，对鼻咽组织总RNA反转录产物的cDNA模板及合成引物，通过运用普通PCR仪分别进行PCR反应、琼脂糖电泳进行有效性验证。④Real－time PCR检测:将验证有效的cDNA模板及引物Lin28A、Lin28B、Let－7amiRNA和U6snRNA分别进行Real－time PCR。具体步骤按照SYBR Green（TOYOBO，日本）说明书主要包括准备Real－time PCR反应体系，于LightCyclerTM（Roche公司）Real－time PCR仪上进行扩增反应。⑤Real－time PCR数据分析:Real－time PCR数据用2－ΔΔCt方法求得目的基因相对于内参基因的相对表达量，Ct（threshold cycle）为实时定量PCR反应中的临界循环数；ΔCt＝Ct靶cDNA－Ct内参cDNA（即靶基因Ct值与内参基因Ct值的差值）。ΔΔCt可表示目的基因在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中的表达差异程度；2－ΔΔCt表示鼻咽癌组织中靶基因相对于非鼻咽癌组织的表达情况，2－ΔΔCt＞2为表达上调，2－ΔΔCt＜0.5为表达下调。

表1 引物序列表Table1 List of primer sequences

1.4.2 免疫组织化学分析 参照文献介绍的方法，以已确诊的恶性肿瘤组织（喉癌切片）为阳性对照，以未加一抗的鼻咽癌组织为试剂对照，对全部鼻咽组织标本进行免疫组织化学检测。主要步骤如下:对活检组织石蜡切片进行常规脱蜡、脱水，滴加4%多聚甲醛（37℃孵育30min），微波柠檬酸修复液（pH6.0，0.01mol／L）热修复抗原，自然冷却，蛋白酶K修复液（37℃孵育10min）修复抗原，3%H2O2（37℃孵育20min），滴加5%BSA封闭液（37℃30 min），滴加小鼠抗人Lin28单克隆抗体一抗（AB－cam，USA，1∶50倍稀释），置入湿盒4℃冰箱过夜。取出过夜的湿盒复温（37℃复温30min），滴加生物素化山羊抗小鼠二抗（37℃孵育30min），滴加适量SABC（37℃孵育30min），使用DAB试剂盒显色（AR1022），苏木精染核3min，流水冲洗20min，脱水，透明，中性树脂封片，显微镜下观察、采图。结果分析:以组织细胞中出现棕褐色染色为Lin28表达阳性，依据棕褐色颜色深浅判定为强、中、弱表达；并对细胞内不同部位的阳性染色进行表达定位分析。

1.5 数据处理及统计学分析

运用Graphpad Prism 5制作条形图；用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行非参数检验分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义；用Sigmaplot软件对鼻咽癌组织中Let－7和Lin28的Real－time PCR实验结果进行相关性分析。

2 结果

2.1 Real－time PCR检测

与对照组比较，实验组中Lin28AmiRNA相对表达量增高（P＝0.020），Lin28BmiRNA相对表达量增高（P＝0.047），而Let－7amiRNA的相对表达量降低（P＝0.027），差异均有统计学意义（图1）。

2.2 Lin28和Let－7a miRNA相关性分析

经相关性分析发现，鼻咽癌组织中Lin28A／B miRNA的相对表达量与Let－7amiRNA的相对表达量分别表现为负相关关系（图2）。

图1 Lin28A／B miRNA和Let－7amiRNA在鼻咽癌和正常鼻咽组织中的相对表达量Fig.1 The relative expression levels of Lin28A／B miRNA and Let－7amiRNA in nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharyngeal tissues

图2 Lin28A／B miRNA和Let－7amiRNA在鼻咽癌组织中表达量的相关性Fig.2 The correlation of expression levels of Lin28A／B miRNA and Let－7amiRNA in nasopharyngeal carcinoma tissues

2.3 免疫组织化学检测

作为阳性对照的所有喉癌组织切片，Lin28蛋白染色均呈强阳性；在鼻咽癌组织切片中，Lin28中等阳性21／26例（80.77%），弱阳性5／26例（19.23%），其表达均定位于细胞质（图3）。

3 讨论

Let－7家族是目前研究最广泛的miRNAs。目前发现的人类Let－7家族由12个成员组成，包括Let－7a（1～3）、b、c、d、e、f、g、i和miR－98等［4］。Let－7家族miRNAs的表达是细胞完全分化的标记。在正常组织中，维持在一定水平的Let－7miRNA家族，通过调控靶蛋白的表达，使细胞正常生长、增殖、分化及凋亡。Let－7表达降低时其靶蛋白异常表达，可引起细胞的过度增生、凋亡减少及异常分化，最终可能导致肿瘤的发生。Let－7通过抑制原癌基因如Ras、HMGA2和c－myc等的翻译和表达，进而抑制其致癌作用。临床研究也发现，Let－7家族成员在肺癌等多种人类肿瘤细胞中的表达水平明显下调，Let－7a在喉癌组织和Hep－2细胞系的表达量显著低于癌旁正常组织和BEAS－2B细胞系，提示Let－7家族属于一类肿瘤抑制因子［58］。

迄今的临床研究发现，Lin28蛋白受NF－κB和Myc的直接调控，在许多恶性肿瘤中过度表达［912］。Lin28A／Lin28B是Let－7miRNAs重要的转录后调节因子，可负向调控miRNA的生物合成，进而阻碍其对癌基因的抑制作用［13］。Lin28A／Lin28B和Let－7在转录和转录后水平相互抑制，构成了一种所谓“双向负反馈调节环”［1，14］。Lin28／Let－7反馈环被认为是保持细胞正常状态的重要因素，这一通路的调节障碍势必引起胚胎发育异常和肿瘤、炎症及代谢性疾病的发生。在Lin28／Let－7环中，抑制Lin28A／Lin28B活性可以提高Let－7miRNA的表达，即通过干预Lin28通路可能达到对Let－7表达的精确控制，这为恶性肿瘤和其他疾病的治疗提供了新的思路。

图3 3种不同组织Lin28蛋白表达的免疫组化检测（DAB显色，×400）Fig.3 Immunohistochemistry assay of the expression of Lin28protein in 3different tissues（immunohistochemical staining，×400）

本研究发现，小分子RNA结合蛋白Lin28A和Lin28B的表达在鼻咽癌组织明显高于正常鼻咽组织，而肿瘤抑制性因子miRNA Let－7家族成员Let－7a在鼻咽癌组织的表达量低于正常鼻咽组织，差异具有统计学意义。进一步的相关性分析表明，在鼻咽癌组织中，Lin28A、Lin28B与Let－7amiRNA的表达量呈显著的负相关。免疫组织化学分析也证实，Lin28蛋白在鼻咽癌组织呈阳性表达，定位于细胞质中，细胞核无表达；相反，在对照的正常鼻咽组织中，Lin28蛋白在胞质和胞核中均无表达。这表明miRNA Let－7／Lin28双向负反馈调节环在恶性鼻咽肿瘤中同样存在，并可能与鼻咽癌的发生有一定相关性。一方面，Lin28作为原癌基因可通过降低抑癌性miRNA Let－7的表达，削弱后者对肿瘤细胞的调控作用；另一方面，抑癌性miRNA Let－7的表达下调，必然减弱其对Lin28的负向调控作用，进一步导致后者表达上调，这一恶性循环可能参与了鼻咽上皮细胞的恶变过程，最终导致鼻咽癌的发生发展。因此，miRNA Let－7／Lin28双向负反馈调节异常极可能是鼻咽癌病理机制中的重要分子机制之一。Let－7／Lin28调节环在肿瘤发病中的详细作用及途径，及其与EBV感染及环境致癌因素的相互影响等均有待深入研究，而基于这些研究的肿瘤生物靶向治疗策略也值得进一步的探索。

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（2014－10－04 收稿）

Expression of miRNA Let－7／Lin28 Feedback Loop in Nasopharyngeal Carcinoma and Its Significance

Huang Xiaowen，Rao Lihua＃，Xu Sheng et al
Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the expressions of miRNA Lin28／Let－7，a bidirectional negative feedback loop，in nasopharyngeal carcinoma（NPC），so as to evaluate their role in the pathogenesis of NPC.Methods With normal nasopharyngeal tissues as control，the expressions of miRNA Lin28A／B and miRNA Let－7ain NPC were detected respectively by using realtime PCR technique in NPC tissues and the correlation analysis was performed.Immunohistochemistry（IHC）was used to detect the expression levels and locations of Lin28A／B protein in the NPC tissues.Results Real－time PCR showed that the expression of miRNA Lin28was significantly up－regulated in NPC tissues，and miRNA Let－7awas significantly down－regulated in NPC tissues as compared with the control tissues.There was statistically significant difference in the expressions of miRNA Lin28and miRNA Let－7abetween the tumor and control tissues.IHC analysis demonstrated positive expression of Lin28in NPC tissues，which was located in the cytoplasm，and negative expression of Lin28in normal nasopharyngeal tissues.Conclusion miRNA Lin28is up－regulated and miRNA Let－7adown－regulated in NPC，and there is a significant negative association between them，which indicates that abnormal bidirectional negative feedback of Lin28／Let－7may be involved in the molecular pathogenesis of NPC.

nasopharyngeal carcinoma； Lin28； Let－7； real－time PCR； immunohistochemistry

R766

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.011

黄孝文，男，1962年生，主任医师，E－mail:xwhuang＠tjh.tjmu.edu.cn

＃硕士研究生，现址:湖北省宜昌市第二人民医院耳鼻咽喉头颈外科，宜昌443000