络合铜宫内节育器对大鼠子宫内膜形态学的影响＊

彭祥炽，杨瑞峰，孟天庆，刘 燕，胡珊珊，索进平，熊承良△

1华中科技大学同济医学院计划生育研究所，武汉 430030

2华中科技大学同济医学院生殖医学中心，武汉 430022

3华中科技大学材料科学与工程学院，武汉 430074

络合铜宫内节育器对大鼠子宫内膜形态学的影响＊

彭祥炽1，2，杨瑞峰2，孟天庆2，刘 燕2，胡珊珊1，索进平3，熊承良1，2△

1华中科技大学同济医学院计划生育研究所，武汉 430030

2华中科技大学同济医学院生殖医学中心，武汉 430022

3华中科技大学材料科学与工程学院，武汉 430074

目的 研究络合铜生物高分子复合材料宫内节育器（CuCl2／SiO2／PVA IUD）对大鼠子宫内膜及重要脏器的形态学影响，以初步探讨络合铜宫内节育器的安全性。方法 50只性成熟SPF级雌性SD大鼠，10～12周龄，随机分为5组，每组10只:金属裸铜组（Cu组）、生物基体材料组（SiO2／PVA组）、络合铜低剂量组［CuCl2／SiO2／PVAⅠ，Cu2＋释放率为5～10μg／（220mm2·d）］、络合铜高剂量组［CuCl2／SiO2／PVAⅡ，Cu2＋释放率为10～20μg／（220mm2·d）］和空白对照组（NC组）。在大鼠左侧子宫近阴道段作一切口，朝卵巢方向置入不同材料，分别于置器30d和60d后取置器侧子宫内膜、卵巢及心、肝、脾、肺、肾组织，采用苏木精－伊红染色在光镜下观察其组织病理的形态学改变。结果 各组大鼠心、肝、脾、肺、肾、子宫及卵巢组织的大体观察均正常；置器后30d和60d后大鼠子宫内膜均可见上皮细胞的形态和结构发生了改变，但未见全身其他重要脏器病理改变；与裸铜组比较络合铜组炎症反应轻，其中络合铜低剂量组在置器后30d和60d均呈现轻度炎症反应。结论 与裸铜宫内节育器相比，置低剂量络合铜生物高分子复合材料宫内节育器（CuCl2／SiO2／PVA IUD）大鼠子宫内膜组织病理的形态学改变较小，证明其对子宫内膜的刺激作用较轻微，因而可能减少置器初期的不良反应。

络合铜； 宫内节育器； 子宫内膜； 形态学； 大鼠

前期我们团队研究结果表明:络合铜宫内节育器（intrauterine device，IUD）对大鼠具有与TCu380A同样可逆的避孕效果且无铜离子的爆释行为，但络合铜高剂量组在取器后未能完全恢复生育力，生物材料组不含铜其避孕效果及生育力恢复都未达到TCu380A的水平［1］，这给我们一个启示，不能单一用铜离子来解释其避孕机制及对大鼠子宫内膜的损伤。传统观点认为，含铜IUD通过在宫腔长期缓慢释放铜离子造成对子宫内膜局部组织的损伤，刺激子宫内膜产生以大量的白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞渗出为特征的子宫内膜局部异物反应，引起子宫内膜的无菌性炎症，使精子和胚胎中毒并吞噬精子和受精卵，干扰子宫内膜的代谢，改变宫腔环境使之不适合胚胎的发育和着床从而达到避孕目的［25］。大量的证据表明任何组织和细胞遭受不能耐受的有害因子刺激后都会引起细胞及其间质的物质代谢、组织化学、超微结构乃至光镜和肉眼可见的异常变化［67］，所有有害因素都首先在分子水平上发挥作用，能否辨别出细胞适应、可逆性或不可逆损伤的形态学变化取决于细胞病变的性质和观察方法的敏感度。为了进一步探讨络合铜IUD避孕及副反应发生机制，开发高效、可逆、安全的IUD，有必要利用动物模型，对置器后大鼠重要器官、子宫内膜的组织结构进行病理观察，从细胞水平揭示其避孕及子宫内膜损伤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF（specific pathogen free animals，SPF）级雌性SD（Sprague－Dawley，SD）大鼠50只，10～12周龄，均有生殖能力，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。湖北省实验动物质量合格证No.00012251，许可证号SCXK（鄂）SCXK 2008－0004。

1.1.2 实验材料 络合铜IUD及生物基体材料IUD由华中科技大学材料科学与工程学院提供，金属裸铜IUD材料取自于TCu380A的铜管部分，由武汉卫民医疗器械有限责任公司提供，以上的所有材料均为直径2mm、长5mm的圆柱体。

1.1.3 主要试剂与仪器 主要试剂:4%多聚甲醛，2.5%戊二醛，苏木精－伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒，环氧树脂，枸橼酸铅。实验仪器和器械:超薄切片机（LEICA ULTRACUT UCT，德国）；低温冰箱（MDF－382E，日本三洋）；电子天平（ScoutⅡ型，加拿大梅特勒托力多公司）。

1.1.4 实验分组 按体重分层计算机随机数字化分组。将实验分为5组，每组10只，包括金属裸铜组（简称裸铜组）、不含铜的络合高分子生物基体材料组（简称生物材料组）、络合铜低剂量组、络合铜高剂量组和空白对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 置器 3%戊巴比妥钠（45mg／kg）行腹腔麻醉；无菌操作逐层开腹，暴露子宫，于左侧子宫近阴道端剪开，朝卵巢方向将IUD向子宫中段置入，并用4－0不可吸收手术缝线固定于子宫壁，然后缝合切口；另一侧子宫作为自身对照侧。空白对照组，不做任何手术。所有手术动物在关腹前腹腔给予庆大霉素抗感染，术后1周内每天活力碘涂擦腹部伤口，加强护理。

1.2.2 子宫内膜及全身重要脏器组织学检查 于置器后30d和60d时取材:活体心脏灌流法，每组随机选取3只动物，3%戊巴比妥钠（45mg／kg）行腹腔麻醉，无菌操作打开胸腹腔，暴露心脏，用10号针头从左心刺入升主动脉处，同时剪开左心耳，快速推注生理盐水，待全身血液排尽即主要脏器变白时快速推注4%多聚甲醛，固定后取出置器段子宫（对照组取相应部位）、同侧卵巢、心、肝、脾、肺及肾组织。4%多聚甲醛24h充分固定后，常规石蜡包埋，连续切片（4～5μm），60℃烤片3h，逐级脱蜡至水，行苏木精－伊红（HE）染色，最后脱水，透明，中性树脂封片。风干后在光学显微镜下观察组织学改变。特别说明:其中的子宫因需观察的是置器对子宫内膜的损伤情况，取材的部位为IUD所在的部位，包埋成功后定位于子宫内膜面，分别切片行HE染色。

2 结果

2.1 大鼠重要器官及子宫卵巢的大体改变

对大鼠心、肝、脾、肺、肾、子宫及卵巢的形状、大小、重量、色泽、质地、表面及切面形态、与周围组织和器官的关系进行细致地解剖、观察、测量、取材和记录，其大体结构均无明显的异常变化。

2.2 大鼠全身主要脏器组织形态学改变

置器60d后，金属裸铜组、络合铜高剂量组与空白对照组相比较，大鼠心、肝、脾、肺、肾及卵巢组织均未见明显异常（图1）。

2.3 大鼠子宫内膜组织形态学改变

2.3.1 空白对照组 腺上皮呈单层立方状，无增生，无炎性细胞浸润，无淤血，间质无水肿，基底膜完整（图2）。

图1 络合铜高剂量组（CuCl2／SiO2／PVAⅡ）大鼠主要脏器组织切片图（苏木精－伊红染色，×400）Fig.1 Histopathological images of major organ tissues of rats in high－dose complexing copper－containing IUD group（CuCl2／SiO2／PVAⅡ）（HE staining，×400）

图2 空白对照组大鼠子宫内膜组织病理切片图（苏木精－伊红染色，×400）Fig.2 Histopathological images of endometrial tissues of rats in the normal control group（HE staining，×400）

2.3.2 金属裸铜组 血管高度扩张淤血，伴中性粒细胞炎性浸润（置器30d，图3A）；炎性细胞浸润以淋巴细胞和少量嗜中性粒细胞为主，有假复层柱状上皮增生，但基底膜完整（置器60d，图3B）。

2.3.3 生物材料组 30d时间质水肿，毛细血管高度扩张（置器30d，图3C）；60d时上皮呈灶性增生，间质细胞炎性浸润，以中性粒细胞为主，基底膜不完整，部分缺失（置器60d，图3D）。

2.3.4 络合铜低剂量组 30d时腺体轻度扩张，腔内外有嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润，呈轻度炎症反应（置器30d，图3E）；60d时有轻度炎性细胞浸润，腺上皮呈单层立方状，无增生，基底膜完整（置器60d，图3F）。

2.3.5 络合铜高剂量组 30d时腺体扩张，呈中度炎性细胞浸润（以中性粒细胞和淋巴细胞为主）（置器30d，图3G）；60d时血管扩张淤血，灶性腺上皮增生呈假复层（伴出芽），可见核分裂象（过度增生的表现），基底膜基本完整（置器60d，图3H）。

3 讨论

大体和显微镜水平上的形态学观察技术是病理学研究和学习的最传统技术，也是诊断和研究疾病的最基本方法。50多年来，以Noyes和他的合作者的形态学观察为基础的子宫内膜的组织学评价一直是临床诊断的金标准［8］。IUD是目前最常用的一种可逆的避孕方法之一，但其确切的避孕机制也不完全清楚［910］。子宫内膜的形态及生物化学成分在生殖过程中起着非常重要的作用；这些因素的改变通过干扰精子的获能和子宫内膜的容受性而影响生殖过程［11］。传统观点认为，宫内节育器的构成材料是影响使用效果的重要因素［12］。含铜IUD置入宫腔后直接接触子宫内膜，一方面对子宫内膜局部产生机械性压迫，另一方面因大量铜离子及其它腐蚀产物释放入宫腔，可损伤子宫内膜，影响局部组织细胞代谢功能，引起的无菌性炎症反应比惰性IUD严重［12］。特别是在置器初期，由于铜离子的爆释，对子宫内膜的刺激最为明显。随着带器时间的延长，机体的适应而逐渐减轻。Timonen和Kosonen［1314］对TCu IUD分别在宫腔内铜离子的释放与腐蚀寿命进行了观察，其结果表明TCu IUD具有低的妊娠率并且在其有效期内铜离子一直保持释放，体外实验表明铜还可以通过干扰精子的迁移、精子活力及精子的顶体反应来影响精子的受精能力［1519］。有研究表明IUD带器者与非IUD带器者相比到达受精部位的有受精能力的精子是要少一些，而且仅精子的迁移能力的障碍也减少了其受精的机会。Chang等［20］研究了大鼠宫腔铜离子对鼠囊胚着床的影响，他们将暴露在含铜宫腔里的囊胚移植到正常宫腔结果鼠囊胚正常着床，反之则着床失败，其结果表明宫腔环境的改变参与了避孕机制。受影响的细胞和由其构成的组织、器官在内外环境中的有害因子的刺激作用下首先表现为适应性反应，在形态学上表现为萎缩、肥大、增生和化生。

结合临床上含铜IUD的不良反应多见于置器后最初3个月，本实验以置器大鼠为研究模型，选择了置器后30d和60d两个时间点，即子宫内膜受IUD直接影响最明显时为观察时机。根据前期体外实验的结果，理论上来说，络合铜生物高分子复合材料因避免了裸铜与子宫内膜的直接接触，无置入初期铜离子的爆释且无腐蚀产物沉积在金属表面，因而对子宫内膜损伤应该比金属裸铜材料轻，本实验结果证实了这一点。实验各组均表现出以子宫内膜为中心环节的损伤与机体抗损伤的过程，表现为细胞及亚细胞的水肿、变性、血管扩张及液体的渗出，子宫内膜腺上皮及其血管内皮细胞的再生等炎症反应。络合铜低剂量组无论在大体还是在光镜下形态学改变都比裸铜组轻。而生物材料组及高剂量组仍然表现了不同程度的组织内膜的炎性损伤，其原因还有待进一步的研究。

置器60d后，大鼠心、肝、脾、肺、肾和卵巢组织均未见明显异常，但子宫内膜形态学的变化随各组材料释放的铜离子量增加而递增。组织病理学检查显示络合铜低剂量组的表现最为轻微，仅表现为腺体轻度扩张，和轻度炎症反应，腺上皮呈单层立方状，无增生，基底膜完整。已知无菌性炎症反应是含铜IUD的避孕机制之一［2122］，但过度的炎症反应可能是引起子宫异常出血及疼痛等副反应产生的重要因素之一［23］。有研究表明，置Cu－IUD后子宫内膜微血管普遍存在结构和功能的异常改变，且这些血管的变化在置器后出现异常出血者的子宫内膜表现得更为显著［24］。

综上所述，与传统金属裸铜IUD相比，放置低剂量络合铜高分子复合材料IUD（CuCl2／SiO2／PVA IUD）大鼠子宫内膜组织病理的形态学改变较小，证明其对子宫内膜的刺激作用较轻微，因而可能减少置器初期的不良反应。我们将进一步从亚细胞及分子水平去探讨络合铜IUD的避孕及与副反应发生的可能机制，研发生物相容性更好的新型含铜IUD。

图3 置IUD 30d和60d后各组大鼠子宫内膜组织切片图（苏木精－伊红染色，×400）Fig.3 Histopathological images of endometrial tissues of rats 30and 60days after implantation of IUD in each group（HE staining，×400）

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（2014－09－27 收稿）

Effects of A Novel Complexing Copper－containing IUD on Endometrial Morphology in Rats

Peng Xiangchi1，2，Yang Ruifeng2，Meng Tianqing2et al
1 Family Planning Research Institute，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2 Center of Reproductive Medicine，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To explore the effects of a novel complexing copper－containing intrauterine device（IUD）on the endometrial morphological changes in rats in order to evaluate the safety of the IUD.Methods Fifty female sexually mature Sprague－Dawley（SD）rats at the age of 10－12weeks were randomly divided into five groups:bulk copper group（Cu group，n＝10），SiO2／PVA group（n＝10），CuCl2／SiO2／PVA groupⅠ（copper ion released at 5－10μg／220mm2per day，n＝10）and CuCl2／SiO2／PVA groupⅡ（copper ion released at 10－20μg／220mm2per day，n＝10）and normal control group（NC group，n＝10）.Different IUDs were advanced towards the ovaries and implanted into the uterus through the incision in the left side of the uterus adjacent to the vagina.The endometrial tissues，ovaries，heart，liver，spleen，lungs and kidneys were removed 30and 60days after the implantation of IUD.The morphological changes were observed by using hematoxylin－eosin（HE）staining and light microscopy.Results Gross examination revealed the normal morphology of the heart，liver，spleen，lungs，kidneys，uterus and ovaries in each group.The morphology and structure of the epithelia of the endometrium changed 30and 60days after the implantation of IUD in each group and no obvious changes were found in other important organs.The inflammation was milder in CuCl2／SiO2／PVA groups than in Cu group.Mild inflammation was observed in CuCl2／SiO2／PVA groupⅠat 30and 60 days.Conclusion The morphological changes of the endometrium were less pronounced in the novel complexing copper－containing IUD（low dose）group than in bulk copper－containing IUD group，suggesting that the novel complexing copper－containing IUD induces minor endometrial damage，and it may reduce adverse effects in the initial period of IUD implantation.

complexing copper； intrauterine device； endometrium； morphology； rat

R169.41

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.013

＊武汉市科技局应用性基础研究项目（No.2014060101010044）

彭祥炽，女，1965年生，副主任医师，医学博士，E－mail:121430668＠qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:clxiong951＠sina.com