三阴性乳腺癌中SOCS3和IL－6表达的相关性及临床意义

杨 林，韩思奇

1湖北省妇幼保健院检验科，武汉 430070

2南京军区总医院肿瘤内科，南京 210002

三阴性乳腺癌中SOCS3和IL－6表达的相关性及临床意义

杨 林1，韩思奇2△

1湖北省妇幼保健院检验科，武汉 430070

2南京军区总医院肿瘤内科，南京 210002

目的 探讨三阴性乳腺癌（TNBC）中细胞因子信号转导抑制分子（SOCS3）和白细胞介素6（IL－6）表达的相关性及临床意义。方法 采用免疫印迹和荧光定量PCR方法比较TNBC和正常乳腺细胞株中SOCS3和IL－6的表达情况；应用免疫组织化学方法检测84例TNBC、33例乳腺纤维瘤和11例正常乳腺组织标本中SOCS3和IL－6的表达情况，并分析两者在TNBC中表达的相关性及与临床病理参数的关系。结果 SOCS3在TNBC细胞株中表达缺失或低表达，而IL－6高表达。SOCS3在TNBC的阳性表达率为32.1%，而在乳腺纤维瘤和正常组织中分别为63.6%和72.7%（均P＜0.01）；IL－6在TNBC中的阳性表达率为72.6%，而在乳腺纤维瘤和正常组织中分别为30.3%和27.3%（均P＜0.01）。两者在TNBC中的表达呈显著负相关（rs＝－0.590，P＜0.01）。SOCS3和IL－6的表达与TNBC肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、以及Ki－67表达及p53状态相关（均P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤的组织学分级和绝经状态无关（均P＞0.05）。结论 SOCS3和IL－6的表达与TNBC的发生发展有关，提示其可作为TNBC潜在的预后评估指标和临床治疗的新靶点。

三阴性乳腺癌； SOCS3； 白细胞介素6； 免疫组织化学

三阴性乳腺癌（triple－negative breast cancer，TNBC）临床上定义为雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和表皮生长因子受体2（epidermal growth factor receptor 2，HER2）均阴性的具有独特生物学特性的特殊亚型乳腺癌。TNBC是一个异质性群体，50%～90%的TNBC为基底细胞样亚型，它表达基底细胞样细胞角蛋白（cytokeratin，CK5／6、CK14、CK17）和EGFR，其余包括LuminalA／B亚型等［1］。TN－BC约占乳腺癌病理类型的10%～20%［2］，多发生于绝经前年轻妇女。众所周知，ER、PR以及HER2的阳性表达是乳腺癌内分泌和靶向治疗的靶点，TNBC患者因缺少有效的靶点而对这些治疗不敏感，导致TNBC患者生存期短、复发转移率高、死亡率高［3］。因此，寻找TNBC新的有效的治疗靶点成为目前亟须解决的热点问题。

本文研究TNBC中细胞因子信号转导抑制分子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）和白细胞介素6（interleukin，IL－6）的表达情况，分析它们与TNBC临床病理特征的关系及两者表达之间的相关性，为探索TNBC的靶向治疗策略奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

TNBC细胞系（MDA－MB－157，MDA－MB－231，MDA－MB－468，MCF－7和BT－549）以及正常乳腺细胞（Hs 578Bst，MCF－10A和HBL100）均购自ATCC细胞库，培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.2 免疫印迹法检测

1×106个细胞接种于6孔板，贴壁过夜后，每孔加入200μL细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）冰上裂解20～30min，95℃热浴后离心取上清。用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司）测定蛋白浓度，调整上样量，经SDS－PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜，封闭并孵育一抗二抗后，加入底物进行化学发光。其中一抗为兔抗人SOCS3和IL－6多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），工作浓度1∶1 000；二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔（北京康为世纪生物科技有限公司），工作浓度1∶4 000；GAPDH作为内参。

1.3 实时荧光定量PCR检测

细胞铺于6孔板中，细胞长满后，每孔加入1 mL Trizol溶液（碧云天公司），用Trizol法提取细胞总mRNA，并按逆转录试剂盒（Thermo）说明书进行逆转录后，所获取的cDNA作为PCR反应模板进行实时荧光定量PCR（SYBR GreenⅠ法）检测。其中SOCS3引物（正向，5′－CCTGCGCCTCAAGACCTTC－3′；反向，5′－GTCACTGCGCTCCAGTAGAA－3′）；IL－6引物（正向，5′－ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG－3′；反向，5′－CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG－3′）。

1.4 临床资料

收取湖北省妇幼保健院病理科2008年1月至2013年3月手术切除存档并经病理确诊为TNBC的石蜡包埋组织标本84例。所有患者临床资料齐全，术前均未行放化疗。所有患者均为女性，年龄25～69岁，中位年龄48岁。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期40例。瘤体直径≤2cm 34例，＞2cm 50例；无淋巴结转移46例，有淋巴结转移38例。另收集乳腺纤维瘤33例和癌旁正常乳腺组织11例作为对照。所有病例标本均经两位病理科医师确诊。

1.5 免疫组织化学法检测

组织经石蜡包埋，3μm连续切片后，采用两步法免疫组化检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）按说明书进行操作。兔抗人SOCS3和IL－6多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）工作浓度为1∶100，用已知乳腺癌组织阳性切片作阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照。

1.6 免疫组化染色定量结果判断

免疫组织化学结果判定采用二级计分法，每张切片随机选取5个高倍视野（×400），按阳性比例评分:阳性细胞占总细胞比例＜5%计0分；5%～计1分；25%～计2分；50%～计3分；＞75%计4分。按染色强度分级计分:不显色计0分；淡黄色计1分；黄或深黄色计2分；褐或棕褐色计3分。两者计分相乘的分值作为判定标准:0分为阴性；1～分为弱阳性；5～分为阳性；＞9分为强阳性。统计分析时，＜5分为阴性（－）表达；≥5分为阳性（＋）表达。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对所有数据作统计处理。对于各组的表达差异以及参数的组间差异，计量资料采用方差分析，计数资料采用χ2检验。SOCS3与IL－6表达的相关性检验用Spearman秩相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOCS3及IL－6在TNBC细胞株中的表达

首先用Western blot和Real－time PCR技术检测5株TNBC细胞（MDA－MB－157，MDA－MB－231，MDA－MB－468，MCF－7和BT－549）以及3株正常乳腺细胞（Hs 578Bst，MCF－10A和HBL100）中SOCS3和IL－6的蛋白表达情况和mRNA水平。如图1A所示，SOCS3在TNBC细胞株中表达缺失或低表达，而IL－6高表达。相反，正常乳腺细胞高表达SOCS3而低表达IL－6。同样，在mRNA水平上（图1B），SOCS3在TNBC细胞中的表达显著低于正常乳腺细胞（P＜0.01），而TNBC细胞中的IL－6水平高于正常乳腺细胞（P＜0.01）。

图1 SOCS3和IL－6在TNBC细胞和正常乳腺细胞中的表达Fig.1 The expressions of SOCS3and IL－6in TNBC and normal breast cells

2.2 SOCS3及IL－6在TNBC组织中的表达

进一步采用免疫组化方法检测84例TNBC、33例乳腺纤维瘤和11例正常乳腺组织中SOCS3和IL－6的表达情况。图2所示:SOCS3和IL－6阳性染色定位于细胞胞质，着色深浅不一，呈片状、灶性或弥漫分布，癌细胞核表达量较少。SOCS3在TNBC中的阳性表达率为32.1%（27／84），显著低于乳腺纤维瘤63.6%（21／33）和正常乳腺组织72.7%（8／11）（均P＜0.01）；IL－6在TNBC中高表达，其阳性表达率为72.6%（61／84），显著高于乳腺纤维瘤30.3%（10／33）和正常乳腺组织27.3%（3／11）（均P＜0.01），见表1。Spearman等级相关分析显示:SOCS3和IL－6在TNBC组织中的表达呈显著负相关（rs＝－0.590，P＜0.01）。

图2 免疫组化检测SOCS3和IL－6在TNBC和乳腺纤维瘤中的表达情况（×400）Fig.2 Immunohistochemistry（IHC）staining of SOCS3and IL－6in TNBC and breast fibroma（×400）

表1 TNBC和乳腺纤维瘤组织中SOCS3和IL－6的阳性率［例（%）］Table1 Expressions of SOCS3and IL－6in TNBC and breast fibroma tissues［n（%）］

2.3 SOCS3和IL－6的表达与TNBC患者临床病理特征的关系

由表2可见，在TNBC患者中，SOCS3的表达与肿瘤大小（P＝0.012）、淋巴结转移（P＝0.001）、TNM分期（P＝0.001）和Ki－67高表达（＞30%）（P＝0.034）呈显著负相关，与p53的表达呈显著正相关（P＝0.013）。IL－6的表达与肿瘤大小（P＝0.039）、淋巴结转移（P＝0.034）、TNM分期（P＝0.048）和Ki－67高表达（＞30%）（P＝0.023）呈显著正相关，与p53的表达呈显著负相关（P＝0.035）。两者的表达与患者年龄、病理学分级和绝经状况无关（均P＞0.05）。

表2 TNBC中SOCS3和IL－6的表达与临床病理特征的关系（n＝84）Table2 The relationship between the SOCS3／IL－6expression and clinicopathological parameters in TNBC（n＝84）

3 讨论

细胞因子信号转导抑制分子（SOCS）是JAK／STAT通路重要的抑制性分子，负性调节STAT通路从而抑制下游信号，Croker等［4］研究表明SOCS的激活及表达具有潜在的抑制肿瘤生长作用。同时，某些细胞因子具有诱导SOCS基因表达的作用，这些细胞因子还可通过SOCS3蛋白反馈抑制JAK／STAT信号通路，抑制肿瘤细胞生长［5］。SOCS3基因可以通过抑制JAK／STAT通路，影响IL－6、催乳素和生长激素等多种乳腺癌相关因子所介导的信号转导通路，发挥抑癌作用［67］。本研究发现SOCS在TNBC组织中无表达或低表达，这与文献［8］报道的结果一致:SOCS3在多种不同乳腺癌细胞系均呈少量表达甚至无表达，提示乳腺上皮细胞在恶变的过程中可能发生SOCS3的基因“沉默”，即表达异常关闭，导致乳腺细胞失控性增生及恶性转化。大量研究表明，SOCS3作为SOCS家族最重要的成员之一，在肺癌、肝癌和淋巴瘤等多种肿瘤和细胞系中均发现启动子区CpG岛甲基化异常，从而导致其被关闭表达［810］。

目前，SOCS3与IL－6在TNBC中表达情况以及与临床特征的相关性鲜有报道。本组研究显示，TNBC组织中SOCS3表达水平显著低于乳腺纤维瘤，且与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移呈负相关，即组织学级别越高，肿瘤越大，分化越低，SOCS3表达水平也越低，提示SOCS3在乳腺癌中发挥抑癌作用。其可能机制有:①直接阻止STAT3与受体位点的结合，阻断STAT3通路的异常激活［11］；②通过SOCS家族共有的SH2结构域使JAK激酶的N末端失活而抑制IL－6、催乳素和生长激素等细胞因子的活化，从而抑制他们介导的乳腺发育有关通路的信号［7，12］；③通过SOCS盒基序促进EGFR等靶蛋白发生泛素化等，抑制肿瘤细胞的转移［1314］。本组研究还显示，无论在细胞还是在组织标本中，TNBC中IL－6的表达水平明显高于乳腺纤维瘤组织，且与肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期有关，提示IL－6在乳腺癌组织中的表达可能在一定程度上反映肿瘤的恶性潜能。

另一方面，在TNBC中SOCS3与IL－6的表达呈显著负相关，表明SOCS3和IL－6在TNBC发展转移中是一对相互拮抗的分子，SOCS3关闭表达和IL－6的过表达与TNBC的发生发展、浸润转移等恶性生物学行为有着密切的关系。我们推测，乳腺癌发生的过程中SOCS3关闭表达和IL－6的过表达可能是两个具有标志性意义的相关分子事件。因此，联合检测SOCS3和IL－6可以作为评估TNBC恶性潜能的重要标准，同时，SOCS3和IL－6可作为潜在的靶标，指导TNBC的靶向治疗。

本实验结果还提示SOCS3和IL－6可能与p53的表达存在某种联系。在p53阴性的TNBC组织中，SOCS3的表达也相应较低，IL－6则升高，提示三者在TNBC中存在相互调节的关系，需要通过进一步实验加以证实。是否还有其他因素参与SOCS3和IL－6在转录后水平调控，是否还有更重要的接头蛋白存在于STAT信号转导通路，SOCS3和IL－6在其他类型乳腺癌中是否存在相似的关系，以及SOCS3与转导网络的其它通路如ERK－MAPK等是否存在“cross－talking”现象，这些都是下一步亟待解决的问题。

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（2014－05－09 收稿）

Expressions of SOCS3 and IL－6 in Triple－negative Breast Cancer and Their Chinical Significance

Yang Lin1，Han Siqi2△1Department of Clinical Laboratory，Hubei Maternal and Child Health Hospital，Wuhan 430070，China
2Department of Medical Oncology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing 210002，China

Objective To investigate the expressions of SOCS3and IL－6in triple－negative breast cancer（TNBC）and their clinical significance.Methods The expressions of SOCS3and IL－6in TNBC and normal breast cells were detected by Western blot and fluorescence quantitative PCR.Immunohistochemical staining was used to detect their expressions in 84TNBCs，33 breast fibromas and 11normal breast tissues.The correlation of their expressions in TNBC and the relationship between their expressions and clinical pathological parameters were analyzed as well.Results SOCS3was not expressed or down－expressed in TNBC cell lines while IL－6was over－expressed.The positive rate of SOCS3protein was 32.1%in TNBCs，63.6%in breast fibromas（P＜0.01）and 72.7%in normal breast tissues（P＜0.01）；and that of IL－6protein was 72.6%in TNBCs，30.3%in breast fibromas（P＜0.01）and 27.3%in normal breast tissues（P＜0.01）.Moreover，a significant negative correlation was found between the expression of SOCS3and that of IL－6in TNBC（rs＝－0.590，P＜0.01）.The expressions of SOCS3and IL－6were markedly associated with tumor size，lymph node metastasis，clinical stages and expressions of Ki－67and p53（P＜0.05），but not with age，histological grades or menopausal status（P＞0.05）.Conclusion The expressions of SOCS3and IL－6are associated with the development of TNBC，suggesting that SOCS3and IL－6can serve as biological markers for evaluating the prognosis，and therapeutic targets of TNBC.

triple－negative breast cancer； SOCS3； IL－6； immunohistochemistry

R739

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.016

杨 林，女，1980年生，医学硕士，主治医师，E－mail:liwf80＠gmail.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:hansiqi1228＠126.com