Notch3、pS6在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与临床预后的关系＊

刘朝霞，余筱琳，赖小青，贠荣纳，冯小丽，谭布珍

1广东医学院附属南山医院妇产科，深圳 518052

2南昌大学第一附属医院妇产科，南昌 330006

3河南省新乡市中心医院妇产科，新乡 453000

4珠海市第二人民医院妇产科，珠海 519020

5南昌大学第二附属医院妇产科，南昌 330006

Notch3、pS6在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与临床预后的关系＊

刘朝霞1＃，余筱琳2＃，赖小青1＃，贠荣纳3，冯小丽4，谭布珍5△

1广东医学院附属南山医院妇产科，深圳 518052

2南昌大学第一附属医院妇产科，南昌 330006

3河南省新乡市中心医院妇产科，新乡 453000

4珠海市第二人民医院妇产科，珠海 519020

5南昌大学第二附属医院妇产科，南昌 330006

目的 探讨Notch3、pS6蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与临床病理学特征及总生存期的关系。方法采用免疫组化法检测30例正常卵巢上皮组织、30例卵巢囊腺瘤以及120例上皮性卵巢癌组织中Notch3及pS6蛋白的表达。结果 Notch3、pS6蛋白在正常卵巢组织、良性卵巢囊腺瘤组织、上皮性卵巢癌组织中均有阳性表达，阳性率分别为16.7%、70.0%、91.7%和16.7%、76.7%、90.0%，上皮性卵巢癌中Notch3、pS6蛋白的表达显著高于正常卵巢组织及良性卵巢囊腺瘤组织（均P＜0.01），与临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移及腹水有关，与患者年龄无关。Notch3蛋白与pS6蛋白在上皮性卵巢癌中的表达呈正相关（rs＝0.668，P＜0.01）。Notch3及pS6高表达组总生存期较短，低表达组的总生存期明显较长（χ2＝41.479，P＜0.01）。Notch3和pS6高表达组腹水阳性率为82.1%，显著高于中表达组（51.9%）及低表达组（27.0%）（χ2＝28.448，P＜0.01）。结论 上皮性卵巢癌组织中Notch3、pS6蛋白的高表达与患者生存期（不良预后）密切相关，高表达Notch3及pS6患者总生存期缩短。

上皮性卵巢癌； Notch信号通路； mTOR通路； Notch3； pS6

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，大多数患者确诊时已属晚期，多伴有腹腔种植及转移，故总死亡率一直居于高位。尽管手术技术及化疗方案不断改进，晚期患者的有效治疗率仍仅为15%～20%。研究发现，Notch信号通路的抑制、基因突变或异常激活存在于多种恶性肿瘤当中。Notch信号的异常激活不仅能直接引起肿瘤的发生，而且它可通过与其他多条信号通路的交互作用，以间接的方式最终诱导肿瘤的形成。许多深入的研究显示PI3K／Akt／mTOR信号通路是Notch信号的关键下游中介［14］，该通路在恶性肿瘤细胞增殖、血管新生和转移以及肿瘤对放、化疗的拮抗中起着重要作用［5］。核糖体蛋白S6激酶（ribosomal S6－kinase，S6K）是mTOR的下游效应分子，当PI3K／Akt／mTOR通路被激活后，S6K磷酸化（pS6K）而被活化，进而磷酸化核糖体蛋白S6，从而对蛋白合成进行调节。Notch3和pS6在上皮性卵巢癌组织中表达的特点及对预后影响的意义，目前国内外尚未见这方面的研究报道。本实验的目的是检测Notch3、pS6在上皮性卵巢癌组织中的表达情况，并分析上述分子的表达水平变化与上皮性卵巢癌临床病理学特征及预后的关系，从而为临床上对上皮性卵巢癌的预后判断提供理论依据，并为上皮性卵巢癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 标本选取1998年12月至2008年12月在南昌大学第一附属医院因上皮性卵巢癌接受手术治疗且临床病理资料完整的患者共120例，年龄36～68岁，平均（49±6）岁。所有患者均行手术治疗，术前均未行化疗及免疫治疗。其中41例Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌患者行子宫全切除＋双侧附件切除＋大网膜切除＋阑尾切除＋盆腔淋巴清扫术，79例晚期（Ⅲ～Ⅳ期）卵巢癌患者均行肿瘤细胞减灭术及盆腔淋巴清扫或淋巴结活检术，37例有淋巴结转移，70例患者有明显腹水。病理类型:浆液性癌77例，黏液性癌43例；病理分化程度:高分化17例，中分化40例，低分化63例。选取同期于本院因卵巢良性囊腺瘤行囊肿剥除或一侧附件切除者30例（浆液性囊腺瘤14例，黏液性囊腺瘤16例），患者年龄23～46岁，平均（35±7）岁。另选取同期于本院因子宫肌瘤或子宫腺肌病及其他非卵巢病变行子宫全切除＋单侧（或双侧）附件切除术者共30例作为对照，患者年龄46～69岁，平均（58±9）岁；术后病理检查证实为正常卵巢。卵巢癌患者中，12例术后未行化疗，44例术后行顺铂联合阿霉素、环磷酰胺化疗，64例术后行卡铂联合紫杉醇化疗。

1.1.2 主要试剂和抗体 EnvisionTM二步法检测试剂、PBS磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐抗原修复液（福建迈新生物技术开发有限公司），DAB显色剂、苏木精、中性树胶（北京中杉金桥生物技术有限公司），Notch3抗体（Santa Cruz公司）、p70S6K抗体（Cell Signaling Technology公司）。

1.2 方法

所有组织标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋连续切片，厚4μm，作免疫组织化学染色。结果判定:细胞质和（或）胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应。由2位病理学医师在不知临床病理学资料的情况下对免疫组化的结果进行评估。在高倍镜（×200）下，随机取5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，按阳性细胞数的平均百分数进行计分［6］。0.0%～记0分，5.0%～记1分，25.0%～记2分，50.0%～记3分，＞75.0%记4分。染色强度按多数阳性细胞呈现的染色特征计分。未着色记0分，染色呈淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。最后根据阳性细胞的百分比和染色强度计分之和进行结果判定。阴性（－）:0～1分；阳性（＋）:2～4分；强阳性（⧺）:5～7分。

1.3 统计学方法

统计学分析利用SPSS 13.0统计软件进行。多组间的差异用Wilcoxon和Kruskal－Wallis检验，用Spearman等级相关进行相关性分析，用Kaplan Meier法进行生存分析，假设检验选用Log rank test，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Notch3、pS6蛋白在不同卵巢组织中的表达

免疫组化结果显示，上皮性卵巢癌组织中Notch3主要表达于肿瘤细胞的胞质和（或）胞核。pS6主要表达于肿瘤细胞胞质中。

由表1可见，Notch3蛋白在正常卵巢上皮、卵巢囊腺瘤、上皮性卵巢癌组织中均有不同程度的表达。从正常卵巢上皮、卵巢囊腺瘤到上皮性卵巢癌，Notch3的阳性表达率呈递增趋势，分别为16.7%、70.0%、91.7%，各组间差异显著（P＜0.01）；进一步两两比较发现，上皮性卵巢癌组织中Notch3的表达显著高于正常卵巢上皮、卵巢囊腺瘤（均P＜0.01），正常卵巢上皮与卵巢囊腺瘤之间表达差异也有统计学意义（P＜0.01）。

pS6蛋白在正常卵巢上皮、卵巢囊腺瘤、上皮性卵巢癌组织中均有不同程度的表达。从正常卵巢上皮、卵巢囊腺瘤到上皮性卵巢癌，pS6的阳性表达率呈递增趋势，分别为16.7%、76.7%、90.0%，各组间差异显著（P＜0.01）；进一步两两比较发现，上皮性卵巢癌组织中pS6的表达显著高于正常卵巢上皮、卵巢囊腺瘤（均P＜0.01），正常卵巢上皮与卵巢囊腺瘤之间表达差异也有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 上皮性卵巢癌组织中Notch3、pS6蛋白表达与临床病理特征的关系

上皮性卵巢癌组织中Notch3、pS6蛋白表达与临床病理特征的关系见表2、3。

由表2可见，上皮性卵巢癌组织中Notch3蛋白的表达与临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移及有无腹水均有关（均P＜0.01），与患者的年龄无关（P＞0.05）。临床分期为Ⅲ～Ⅳ者Notch3蛋白的表达强于Ⅰ～Ⅱ期患者；病理分级越高其Notch3蛋白的表达越强；从组织类型可见，浆液性囊腺癌的Notch3蛋白的表达强于黏液性囊腺癌；有淋巴转移者Notch3蛋白的表达强于无淋巴结转移者；有腹水者Notch3蛋白的表达强于无腹水者。

表1 Notch3、pS6蛋白在不同卵巢组织中的表达Table1 The protein expressions of Notch3and pS6in different ovarian tissues

表2 Notch3表达与临床病理特征的关系Table2 The relationship between Notch3expression and clinical pathological characteristics in ovarian epithelial cancer tissues

表3 pS6表达与临床病理特征的关系Table3 The relationship between pS6expression and clinical pathological characteristics in ovarian epithelial cancer tissues

由表3可见，上皮性卵巢癌组织中pS6蛋白的表达与临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移及有无腹水有关（P＜0.05或P＜0.01），与患者的年龄无关（P＞0.05）。临床分期为Ⅲ～Ⅳ期者pS6蛋白的表达强于Ⅰ～Ⅱ期患者；病理分级越高其pS6蛋白的表达越强；从组织类型可见，浆液性囊腺癌的pS6蛋白的表达强于黏液性囊腺癌；有淋巴转移者pS6蛋白的表达强于无淋巴结转移者；有腹水者pS6蛋白的表达强于无腹水者。

2.3 上皮性卵巢癌组织中Notch3与pS6表达的关系

由表4可见，上皮性卵巢癌组织中Notch3与pS6的表达呈正相关（rs＝0.668，P＜0.01）。

表4 Notch3与pS6的相关性Table4 The association between Notch3and pS6

2.4 生存分析

2.4.1 随访的64例上皮性卵巢癌患者生存情况对64例术后接受卡铂和紫杉醇化疗的上皮性卵巢癌患者进行了随访调查，其中，死亡46例，失访或截尾人数18人，患者的生存时间最短为1个月，最长为102个月，平均生存期为35.16个月。患者1～5年的累积生存率分别为0.55、0.36、0.36、0.28、0.21，生存分布函数见图1。

图1 随访的64例上皮性卵巢癌患者的生存分布函数Fig.1 The survival distribution function of 64ovarian epithelial cancer patients on follow－up

2.4.2 Notch3、pS6表达对生存期的影响 将64例（术后接受卡铂和紫杉醇化疗）有随访资料的卵巢癌患者分为3组:①Notch3及pS6高表达组，两者均为“＋＋”，n＝42；②Notch3及pS6低表达组，两者均为“－”，n＝18；③Notch3及pS6中表达组，Notch3或pS6仅其中一项高表达者，n＝4。结果发现Notch3及pS6高表达组总生存期较短，低表达组的总生存期明显较长（χ2＝41.479，P＜0.01）。见表5。

表5 不同Notch3、pS6表达患者的生存期分布Table5 The distribution of survival time of patients with different Notch3and pS6expressions

2.4.3 上皮性卵巢癌患者多因素COX回归分析对64例上皮性卵巢癌患者进行了随访调查，其中，死亡46例，失访或截尾人数18人，以患者的生存时间和生死为应变量，以患者的年龄（＜50岁为“1”，≥50岁为“2”）、临床分期（Ⅰ～Ⅱ期为“1”，Ⅲ～Ⅳ期为“2”）、病理分级（G1为“1”，G2为“2”，G3为“3”）、组织类型（浆液性囊腺癌为“1”，黏液性囊腺癌为“2”）、淋巴结转移（有为“1”，无为“2”）、腹水（无为“1”，有为“2”）、Notch3（－为“0”，＋为“1”，⧺为“2”）、pS6（－为“0”，＋为“1”，⧺为“2”）为自变量，采用多因素COX回归分析，用向前wald法进行逐步回归分析。纳入变量的水准为0.05。结果发现:临床分期对患者的生存期有影响，临床分期Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期相比，其风险比例为HR＝5.398（95%CI 1.154～25.259）；Notch3的表达也与患者的生存期有关，高表达者的危险比例为HR＝8.362（95.0%CI 2.154～32.461）。见表6。

表6 上皮性卵巢癌患者多因素COX回归分析Table6 Multiple COX regression analysis of patients with ovarian epithelial cancer

2.4.4 Notch3和pS6联合表达与腹水的关系 由表7可见，Notch3和pS6高表达组患者腹水阳性率82.1%，中表达组腹水阳性率为51.9%，低表达组腹水阳性率为27.0%，3种不同表达组间腹水阳性率存在显著差别（χ2＝28.448，P＜0.01）。经卡方检验发现，3组间腹水阳性率均有差别，即高表达组阳性率最高，中表达组次之，低表达组最弱。

表7 Notch3和pS6联合表达与腹水的关系Table7 Relationship between the co－expression of Notch3and pS6and ascites

3 讨论

Notch信号通路是一个在进化过程中高度保守的信号通路，它通过介导细胞和细胞之间直接接触，调控机体的细胞凋亡、增殖及其分化。1991年，Notch1在人类急性T淋巴细胞白血病（T－ALL）中被鉴定出来，首次提示Notch信号通路与肿瘤相关［7］。随后的研究发现，Notch信号通路在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中存在异常表达。Rose等［8］研究发现Notch1的活化与卵巢癌细胞的增殖密切相关。另有研究发现对顺铂耐药的卵巢癌细胞中Notch1表达上调［910］。近年研究发现Notch3基因与肿瘤的发生关系密切，其在信息传递过程中起着重要作用，并参与胚胎发育过程中特异性细胞凋亡的过程，但其在卵巢癌中的调控机制研究尚不足。

我们的研究显示，Notch3蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达明显高于卵巢良性囊腺瘤及正常卵巢组织（H＝74.313，P＜0.01），尤其在浆液性囊腺癌表达增强，且Notch3蛋白的过表达与临床分期、病理分级、组织类型、淋巴转移、腹水有关，提示Notch信号通路在上皮性卵巢癌组织中处于被激活的状态，在卵巢上皮性癌的发生发展中起到了重要的作用。另外我们对64例术后接受卡铂和紫杉醇化疗的上皮性卵巢癌患者进行了随访调查，结果显示患者1～5年的累积生存率分别为0.55、0.36、0.36、0.28、0.21。采用多因素COX回归分析发现:临床分期对患者的生存期有影响，Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期相比，其风险比例为HR＝5.398（95.0%CI 1.154～25.259）；Notch3的表达也与患者的生存期有关，高表达者的危险比例为HR＝8.362（95.0%CI 2.154～32.461），提示Notch3高表达及FIGO分期是卵巢上皮性癌的独立不良预后因素，因此Notch3可作为判断卵巢癌预后的指标之一。

肿瘤的发生是多种信号传导紊乱的综合结果。研究显示PI3K／Akt信号通路是Notch信号的关键下游中介［14］。Cantley［11］在Notch信号通路促进干细胞增殖机制的研究中发现:Notch配体激活Notch通路，经PI3K－Akt旁路起始的胞质磷酸化级联途径调节细胞增殖，进而激活下游mTOR。mTOR活性增强后激活其下游效应分子，S6K和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E－binding protein 1，4EBP1）。S6K活化后促进磷酸化核糖体蛋白pS6以及翻译调节蛋白p4EBP1的合成，从而对蛋白合成进行调节。在造血系统T－ALL中可以观察到Notch信号通路的持续激活，同时伴随有mTOR信号通路的持续激活。

本研究结果显示，pS6蛋白在上皮性卵巢癌中呈高表达，显著高于良性卵巢囊腺瘤及正常卵巢组，并且发现Notch3与pS6呈正相关（rs＝0.668，P＜0.01），提示PI3K／Akt／mTOR信号通路在上皮性卵巢癌的发生发展中起了重要作用，且Notch及PI3K／Akt／mTOR信号通路在功能上具有相关性。

另外将64例术后接受卡铂和紫杉醇化疗的卵巢癌患者，根据Notch3及pS6表达情况，分为高表达组、低表达组及中表达组3组。结果发现Notch3及pS6高表达组总生存期较短，低表达组的总生存期明显较长（χ2＝41.479，P＜0.01）。提示Notch3及pS6联合可作为判断卵巢癌预后的综合指标之一。同时对120例上皮性卵巢癌患者是否伴有腹水的研究发现，Notch3和pS6高表达组患者腹水阳性率显著高于低表达组及中表达组。提示Notch3和pS6的高表达可能与腹腔种植播撒有关。

综上所述，Notch3与pS6在上皮性卵巢癌的发生发展中可能存在一定的相关性，Notch3、pS6蛋白的高表达与患者生存期密切相关，两者联合使用可作为判断卵巢癌预后的综合指标之一。

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（2014－09－23 收稿）

Expressions of Notch3 and pS6 in Ovarian Epithelial Cancer Tissues and Their Relationship with Clinical Prognosis

Liu Zhaoxia1＃，Yu Xiaolin2＃，Lai Xiaoqing1＃et al
1Department of Obstetrics and Gynecology，Nanshan Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Shenzhen 518052，China
2Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

Objective To investigate the protein expressions of Notch3and pS6in ovarian epithelial cancer tissues，and to explore their relationship with the clinical pathological characteristics and overall survival time.Methods Immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of Notch3and pS6in different ovarian tissues，including 30cases of normal ovarian tissue，30cases of benign ovarian cystadenoma and 120cases of ovarian epithelial cancer.Results Notch3and pS6proteins were positively expressed in normal ovarian tissue，benign ovarian cystadenoma and ovarian epithelial cancer and the positive rates were 16.7%，70.0%，91.7%and 16.7%，76.7%，90.0%，respectively.The expression levels of Notch3and pS6in ovarian epithelial cancer were significantly higher than those in normal ovarian tissue and benign ovarian cystadenoma（P＜0.01）.The levels of Notch3and pS6protein expression were associated with clinical stages，pathological grades，histological types，lymphatic metastasis and ascites，but not with age.The protein expression levels of Notch3were positively correlated with those of pS6（rs＝0.668，P＜0.01）.Patients with high expression of Notch3and pS6had shorter overall survival time，while those with lower Notch3and pS6protein expression had significantly longer overall survival time（χ2＝41.479，P＜0.01）.The ascite rate was 82.1%in high Notch3and pS6expression group，significantly higher than in groups with moderate（51.9%）and low expression of Notch3and pS6（27.0%）（χ2＝28.448，P＜0.01）.Conclusion Notch3and pS6are closely associated with survival time（poor prognosis）of patients with ovarian epithelial cancer.Patients with overexpression of Notch3and pS6have shorter overall survival time.

epithelial ovarian cancer； Notch signaling pathway； mTOR pathway； Notch3； pS6

R737.31

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.020

＊深圳市南山区科研基金资助项目（No.2013015）

＃同为第一作者

刘朝霞，女，1970年生，主任医师，副教授，E－mail:lzxia77＠163.com；余筱琳，女，1974年生，副主任医师，讲师，E－mail:zyg0511＠hotmail.com；赖小青，女，1972年生，主治医师，E－mail:lai00606＠163.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:tanbuzhen＠tom.com