氢氧化钠抑制原位移植性肝癌生长机制研究*

李勇 郑筠 党亚正 陆婉玲 刘军 齐涛

(1. 解放军第323医院肿瘤中心， 陕西 西安 710054；2. 乌鲁木齐市中医医院， 新疆 乌鲁木齐 830000)

氢氧化钠抑制原位移植性肝癌生长机制研究*

李勇1郑筠2党亚正1陆婉玲1刘军1齐涛1

(1. 解放军第323医院肿瘤中心， 陕西 西安 710054；2. 乌鲁木齐市中医医院， 新疆 乌鲁木齐 830000)

目的 探讨氢氧化钠溶液瘤内注射对原位肝癌的生长抑制作用，研究抵抗肝癌生长的临床机制。方法 获得稳定表达红色荧光蛋白DsRed的人肝癌细胞系SMMC-7721，进行不同浓度氢氧化钠溶液刺激，并使用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测细胞凋亡。建立裸鼠原位肝癌模型，于第7天进行不同浓度氢氧化钠溶液原位瘤内注射，利用小动物活体荧光成像技术观察肿瘤生长情况。利用免疫组织化学法检测残存肿瘤组织中VEGF表达，并使用TUNEL法检测瘤体内细胞凋亡。结果 氢氧化钠溶液刺激肝癌细胞后，显著增加细胞凋亡比例。成功建立裸鼠原位肝癌模型并进行氢氧化钠溶液注射。在荧光成像系统下，激发光波长570nm,发射波长610nm，于细胞接种后第21天观测到发红色荧光的肿瘤。取肝脏进行原位瘤体积测定，发现与生理盐水瘤内注射相比，氢氧化钠显著抑制了原位瘤生长并引起瘤组织坏死。氢氧化钠抑制了瘤体中VEGF的表达，并增加了TUNEL阳性细胞(即凋亡细胞)比例。结论 氢氧化钠瘤内注射有效抑制裸鼠原位肝癌生长,这可能是通过抗血管生成作用和诱导凋亡作用实现的。

肝细胞肝癌； 氢氧化钠； VEGF； TUNEL

肝癌在我国恶性肿瘤中的发病率及死亡率均居前三位，到目前为止仍以外科治疗为主，但临床上大多数病人在就诊时，病期已属中晚期，失去手术机会。经皮瘤内药物注射(percutaneous anti-cancer agents injection,PACAI)已在晚期肝癌患者中广泛应用。本研究前期试验表明，氢氧化钠的消融作用优于无水乙醇和乙酸，但低浓度氢氧化钠抑制肝癌原位生长的机制仍不清楚。本研究将进一步对氢氧化钠抵抗肝癌原位生长的机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 试剂氢氧化钠(NaOH)根据试验需要由生理盐水配置成0.5%、1%溶液，和生理盐水均采用高温灭菌。免疫荧光专用Dish购自Matrigel，基质胶来自BD公司，TUNEL荧光法检测试剂盒®(DeadEnd®Fluorometric TUNEL System)及比色法检测试剂盒(DeadEnd®Colorimetric TUNEL System)均购于Promega公司,VEGF抗体购于SantaCruz公司。生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒及DAB显色试剂盒购于中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与NaOH处理后TUNEL染色 将DsRed-Neo载体转染入人SMMC-7721 肝癌细胞系(来自中科院上海细胞所细胞库)，经G418筛选后获得稳定表达红色荧光DsRed的7721-DsRed肝癌细胞系。细胞培养采用含10%胎牛血清、1%青/链霉素的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱。7721-DsRed细胞于处理前24小时接种于免疫荧光专用Dish中(n=3)，经生理盐水或0.5%、1%NaOH溶液处理10分钟后，利用TUNEL荧光法细胞凋亡检测试剂盒依照产品说明书进行染色。染色完成后，于倒置荧光显微镜下激发绿色荧光(TUNEL阳性染色)，每只平皿于400倍镜下随机拍摄5个视野。细胞核使用DAPI进行衬染。

1.2.2 裸鼠肝原位模型建立与分组处理 BALB/c雄性裸鼠购于第四军医大学动物中心，并于恒温、恒湿的SPF级别动物实验室饲养。取4～6周龄BALB/c裸鼠，消毒裸鼠腹部皮肤，使用戊巴比妥麻醉。将3×106处于对数生长期7721-DsRed细胞与matrigel混匀形成细胞悬液。沿裸鼠左肋弓下缘切一长约1cm斜行无菌切口，剥开腹肌，暴露肝脏。抽取0.1ml细胞matrigel悬液，使针尖与裸鼠肝脏呈30°进针，刺入肝脏约0.3cm，缓慢注入细胞悬液。注射完毕后，用明胶海绵压迫止血30s；逐层缝合腹肌和皮肤。建立人肝癌细胞裸鼠肝原位转移模型。

7天后戊巴比妥麻醉下开腹探查，将裸鼠按照肿瘤大小分为三组，每组8只。①对照组瘤内注射生理盐水0.1ml/只。②0.5% NaOH组瘤内注射0.1ml/只。③1% NaOH组瘤内注射0.1ml/只。2只裸鼠止血缝合后分笼饲养。

1.3 观察指标 分别在细胞接种后第7、14、21天三个时间点(即瘤内注射后第0、7、14天)对3组裸鼠进行称重。接种后第21天麻醉各组裸鼠，分别使用小动物活体荧光影像系统摄像观察肿瘤的生长情况。用游标卡尺测量原位瘤长短径，计算原位瘤体积(V=长径×短径2/2)。取原位残存癌灶进行石蜡包埋，制作切片备用。应用免疫组化染色及TUNEL染色法，观察裸鼠肝原位残存癌灶癌细胞中VEGF表达及TUNEL阳性细胞比例变化。

1.4 统计学分析 使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析和图表绘制。应用Student’st检验或One-way ANOVA检验进行两样本或多样本间统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外NaOH溶液处理后细胞凋亡情况 经0.5%或1% NaOH溶液处理10分钟后，7721-DsRed中TUNEL阳性细胞比例0.5% NaOH组与生理盐水组相比明显增加(P<0.05)，1%NaOH组显著增加(P<0.01)。TUNEL法检测的凋亡细胞，其阳性染色定位于细胞核内，呈弥漫性分布，见图1。

图1 NaOH溶液处理后TUNEL检测结果。

Figure 1 The results of TUNEL assay for apoptosis detection in HCC cells treated with sodum hydroxide

注：A. 荧光显微镜下TUNEL染色情况。B.TUNEL阳性细胞比例统计。

2.2 裸鼠肝原位模型 NaOH处理后变化在接种瘤细胞后早期，各组裸鼠状态良好。生理盐水组原位瘤裸鼠出现皮肤干燥、消瘦、活动减少及体重下降的现象，晚期可见裸鼠腹部高度膨隆，形体消瘦，呈恶病质状态。而0.5%、1%NaOH溶液组裸鼠体重无明显改变，与生理盐水组存在显著差异(P<0.001)(见图2A)。应用小动物荧光成像技术发现，与PBS瘤内注射组相比，0.5%、1% NaOH溶液注射后肿瘤明显缩小(见图2B)；原位瘤体积在各组间存在显著差异(P<0.01),见图2C。

图2 NaOH溶液瘤内注射对裸鼠肝原位成瘤影响

Figure 2 Orthotopic intrahepatic model of hepatocellular carcinoma

注：A. 各组裸鼠体重变化情况；B.体内荧光成像代表性结果； C.各组原位瘤体积

2.3 VEGF与TUNEL表达 免疫组化染色发现，NaOH瘤内注射显著降低了坏死区周围肿瘤细胞中VEGF表达；TUNEL比色法检测发现，肿瘤细胞中TUNEL阳性细胞比例显著增加，即NaOH瘤内注射增强了肿瘤细胞的凋亡,见图3。

图3 NaOH溶液瘤内注射对原位瘤体VEGF表达及细胞凋亡的影响

Figure 3 Effects of sodum hydroxide on VEGF expression and cell apoptosis detected by immunohistochemistry and TUNEL assay

3 讨论

根据世界卫生组织(WHO)发表的《全球2014癌症报告》，中国新增癌症病例迅猛增长，其中肝癌新增病例和死亡人数居世界首位[1]。其在全世界恶性肿瘤中发病率位于第五位，致死率在排在第三位，是严重威胁人类健康的恶性肿瘤。肝细胞癌发展快、治疗难度大、病死率较高[2]。

目前手术切和肝移植除仍然是治疗肝癌的首先方法，但由于肝癌发病多隐匿，早期诊断率低，发展快、易转移，一旦出现临床症状，常已无手术指征；同时受限于存在肝脏储备不足、肿瘤直接侵犯门静脉或肝静脉、早期播散至邻近器官或远处转移等因素，总的手术率低于27%，且手术治疗后五年复发率较高[3]。而经皮肝癌瘤内药物注射作为治疗肝癌的一种重要手段，Ohto首次报道因其较好的疗效和简单经济的治疗方法日益受到关注[4,5]。以往的肝癌瘤内注射药物主要包括无水乙醇和乙酸，但二者在治疗过程中仍存在着对瘤灶的渗透能力弱 ,注射过程中引起患者疼痛的局限性[6～8]。文献表明，NaOH溶液可作为理想的瘤内注射药物作用于肝癌，但相关的肝癌原位注射模型和具体抑瘤原理仍不明确[9,10]。

本研究通过体内外试验表明，较低浓度的NaOH溶液即能够明显诱导肝癌细胞凋亡。TUNEL法是一种分子生物学与免疫组织化学相结合原位检测凋亡细胞方法，因其灵敏可靠而被广泛用于细胞凋亡的研究[11]。在本研究中，0.5%、1%NaOH溶液处理肝癌细胞后在较短时间内可以检测出明显的TUNEL阳性染色，说明较低浓度的NaOH溶液即可以诱导肝癌细胞凋亡。同时，本研究使用的肝癌原位注射模型相对比体外实验和裸鼠皮下成瘤模型，能够更好的模拟临床体能环境；瘤组织具有较快的生长速度、较强的侵袭和远处转移能力[12]。裸鼠肝原位瘤内注射NaOH溶液后，抑瘤效果明显，瘤内注射后形成局灶性肝癌坏死灶，表现出较好的安全性。VEGF是重要的血管生成因子，在肝癌的发生发展中作用重要[13,14]。NaOH溶液瘤内注射在形成局灶性坏死的同时，残存的肿瘤细胞TUNEL表达增高，出现凋亡，而VEGF则明显下调，肿瘤生长明显抑制。

4 结论

本研究结果表明，较低浓度的NaOH溶液肝原位瘤内注射可以有效抑制肝癌生长，安全性较高，有较广泛的临床应用前景。其主要机制可能与直接的融瘤作用、诱导凋亡及抑制肿瘤血管生成有关。

[1]Stewart BW, Wild CP. World Cancer Report 2014[M]. IARC Nonserial Publication, 2014.

[2]Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet， 2012，379(9822):1245-1255.

[3]Walther Z, Jain D. Molecular pathology of hepatic neoplasms:classification and clinical significance[J]. Patholog Res Int， 2011,403929.

[4]Ohto M, Karsawa E, Tsuchiya Y,etal. Ultrasonicqlly Guided Per-cutaneous Contrast Medium Injection and Aspiration Biopsy Using a Real-time Puncture Transducer[J]. Radiology, 1980,136(1):171-176.

[5]Ho CS, Kachura JR, Gallinger S,etal. Percutaneous ethanol injection of unresectable medium-to-large-sized hepatomas using a multipronged needle: efficacy and safety[J]. Cardiovasc Intervent Radiol，2007,30(2):241-247.

[6]Zuo CJ, Wang PJ, Shao CW,etal. CT-guided percutaneous ethanol injection with disposable curved needle for treatment of malignant liver neoplasms and their metastases in retroperitoneal lymph nodes[J]. World J Gastroenterol,2004,10(1):58-61.

[7]李新丰,吕国荣,李伯义,等.经皮肝穿刺注射醋酸和乙醇治疗原发性肝癌的临床观察[J].中国普外基础与临床杂志,2000,7(4):244-245.

[8]Giorgio A. Percutaneous ethanol injection in the treatment of hepatocellular carcinoma in cirrhosis：a simple，effective and cheap procedure for percutaneous ablation[J]. J Gastrointestin Liver Dis, 2010,19(4):461-462.

[9]Jiang TA, Zhao QY, Chen MY,etal. Low-concentration sodium hydroxide solution injection in normal liver parenchyma of rabbits[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2005,4(2):285-290.

[10] Rao W, Liu J, Zhou YX,etal. Anti-tumor effect of sodium-induced thermochemical ablation therapy [J]. Int J Hyperthermia,2008,4(8):675-681.

[11] Cuello-Carrion FD, Ciocca DR. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique[J]. J Histochem Cytochem,1999,47(6):837-839.

[12] 张海英,李艳茹,王健君,等. 小鼠原位移植性肝癌模型的建立及生物学特性[J]. 吉林大学学报, 2009,35:5-8.

[13] Zhan P, Qian Q, Yu LK. Serum VEGF level is associated with the outcome of patients with hepatocellular carcinoma: a meta-analysis[J]. Hepatobiliary Surg Nutr, 2013,2(4):209-215.

[14] Mukozu T, Nagai H, Matsui D,etal. Serum VEGF as a tumor marker in patients with HCV-related liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J]. Anticancer Res, 2013,33(3):1013-1021.

The mechanism of sodium hydroxide-inhibited growth of hepatocellular carcinoma in orthotopic intrahepatic model

LI Yong1, ZHENG Jun2, DANG Yazheng1,etal

(1.DepartmentofOncology,PLA323Hospital,Xi’an710054,China；
2.UrumqiHospitalofTraditionalChineseMedicine,Urumqi830000,China)

Objective To investigate the effects of sodium hydroxide on hepatocellular carcinoma xenograft in an orthotopic intrahepatic model. Methods SMMC-7721 cells were transfected with a vector to establish a DsRed stably expressed cell line, named as 7721-DsRed. Cells were incubated with different doses of sodium hydroxide or normal saline followed by detection of apoptosis by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). Nude mice bearing 7721-DsRed tumors in livers were injected with different doses of sodium hydroxide or normal saline at day 7 post injection. In vivo DsRed signal was monitored using a Kodak Image Station 4000MM PRO Digital Imaging System. The expression of VEGF and apoptosis in the periphery of the target were detected by immunohistochemistry and TUNEL assay respectively. Results Stimulation of sodium hydroxide significantly increased the percentage of apoptotic HCC cells. The orthotopic intrahepatic model of hepatocellular carcinoma was successfully established. DsRed signal of in situ tumors was detected at the indicated time points (day 21) (excitation and emission wavelengths were 570 and 610 nm respectively). Compared to control group, sodium hydroxide induced necrosis, significantly inhibited the size of in situ tumors and increased the weight of mice. Moreover, the expression of VEGF was suppressed and the percentage of apoptotic cells in tumors was increased. Conclusion By intratumoral injection with sodum hydroxide in the situ HCC tumors of orthotopic intrahepatic model, the growth of tumors was effectively suppressed. The underlying mechanism might be the inhibition of angiogenesis and the induction of apoptosis.

Hepatocellular carcinoma; NaOH; VEGF; TUNEL

陕西省自然科学基金(2010JM4053，2014JM4121)

党亚正，《西部医学》编委，E-mail:dangyz@live.com

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.006

2014-07-22； 编辑： 陈舟贵)