利拉鲁肽对LPS诱导的小鼠肺泡上皮细胞SP-A表达的调控机制研究*

王杰 牟界 张文斌 雷文汇

(重庆市中医院呼吸内科， 重庆 400011)

利拉鲁肽对LPS诱导的小鼠肺泡上皮细胞SP-A表达的调控机制研究*

王杰 牟界 张文斌 雷文汇

(重庆市中医院呼吸内科， 重庆 400011)

目的 探讨胰高糖素样肽-1(GLP-1)拟似物利拉鲁肽对LPS诱导的小鼠肺泡上皮MLE-12细胞损伤的保护作用和对肺表面活性蛋白-A(SP-A)的调节作用。方法 将小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞分为三组即对照组(Control组)、利拉鲁肽+LPS组 (Lir+LPS组)和LPS组。采用MTT法对不同时间点(0、6、12h和24h) MLE-12细胞的活性进行检测。在LPS干预24h后，采用RT-PCR法和western blot法对MLE-12细胞SP-A和甲状腺转录因子-1(TTF-1)的mRNA和蛋白表达进行分析。结果 在LPS (0.5μg/ml)干预后，与未干预细胞相比较MLE-12细胞活性呈时间依赖性降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)；但与LPS组相比较利拉鲁肽+LPS组细胞在6h、12h和24h细胞活性均较高，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。与Control组相比较，在LPS干预12h后MLE-12细胞SP-A和TTF-1的mRNA和蛋白表达均明显降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)；且与利拉鲁肽+LPS组细胞相比较，LPS组细胞SP-A和TTF-1的mRNA和蛋白表达下降更加显著，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。结论 在LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞损伤状态下，GLP-1拟似物利拉鲁肽可以通过促进TTF-1的表达上调SP-A的合成，并对Ⅱ型肺泡上皮细胞产生保护作用。

胰高糖素样肽-1； 利拉鲁肽； MLE-12细胞； 肺表面活性蛋白-A； 甲状腺转录因子-1

肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成与分泌，在维持肺泡的稳定性和肺组织顺应性、调节肺泡表面液体平衡以及调节肺组织固有免疫和炎症反应过程中扮演着重要的角色[1～4]。研究发现在急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)状态下PS的合成和表达明显降低，并且发现PS减少程度与ARDS病情严重程度密切相关[5～7]。同时有研究表明上调和促进PS的表达可以有效延缓或逆转ARDS的疾病进展[8～11]。进一步的基础研究证实甲状腺转录因子-1 (thyroid transcription factor, TTF-1)对PS成分SP-A具有重要的调节作用[12, 13]。实验发现利拉鲁肽(liraglutide)作为GLP-1拟似物具有多种生物活性[14～16]。本实验拟探讨在LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞损伤状态下利拉鲁肽对细胞损伤的保护作用和对SP-A的调节作用以及相关机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司；利拉鲁肽(诺和力)购买于诺和诺德(中国)制药有限公司；兔抗鼠SP-A抗体、兔抗鼠TTF-1抗体和兔抗鼠β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司； DMEM培养基(美国Gibco公司)；小牛血清(杭州四季清)；超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和细胞活性检测 小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞常规接种在含10%胎牛血清(FBS)、100 g/L 青霉素、100 g/L 链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、95%空气、5 % CO2孵箱内培养。每48 h换液、传代2次，取对数生长期细胞用于实验。MLE-12细胞分为对照组(Control组)、利拉鲁肽+LPS组 (Lir+LPS组)和LPS组。其中对照组细胞加入PBS；LPS组和Lir+LPS组加入LPS (0.5μg/ml)；Lir+LPS组加入100 nM的利拉鲁肽溶液进行干预。使用MTT法对对应时间点(0、6、12h和24h) MLE-12细胞的细胞活性进行检测，重复实验4次。细胞活性(%)=对应时间点(OD干预组/OD 对照组)×100 (%)[17]。

1.2.2 RT-PCR法细胞SP-A和TTF-1 mRNA表达检测 干预12h后，按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：SP-A正义：5′ GCTCAGCCTT AAGAACATGTGTAAGC-3′，反义：5′-GCCTCATA CTCTTCTCGTTGGG-3′；TTF-1正义：5′-GTGCCG GTCCTAGTCAAAGA-3′，反义：5′-CAGATGGGAT AGGCTGGAGA-3′和β-actin正义：5′-CGAGCGG GCTACAGCTTC-3′，反义：5′-GTCACGCACGATT CCCTCT-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β-actin PCR产物条带灰度比值作为SP-A和TTF-1 mRNA的相对表达量。

1.2.3 Western blot法检测细胞中SP-A和TTF-1蛋白表达 干预12h后，按试剂盒操作提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗鼠单克隆抗体SP-A (1∶1000)、TTF-1 (1∶1000)和β-actin (1∶2000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

1.3 统计学方法 计量资料以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法结果分析 采用MTT法对不同时间点(0、6、12h和24h)的细胞活性进行测定。在LPS (0.5μg/ml)干预后，与未干预细胞相比较MLE-12细胞活性呈时间依赖性降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)；但与LPS组相比较利拉鲁肽+LPS组细胞在6h、12h和24h细胞活性均较高，差异均有显著统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 MTT比色法测定各时间点MLE-12细胞活性比较

注：对应时间点与对照组相比较①P<0.05，对应时间点与LPS组相比较②P<0.05。

2.2 SP-A mRNA和蛋白的表达水平 在LPS(0.5μg/ml)干预12h后，对MLE-12细胞SP-A mRNA和蛋白的表达水平使用RT-PCR法和western blot法进行检测。与Control组相比较，在LPS干预12h后MLE-12细胞SP-A mRNA和蛋白表达均明显降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)；且与利拉鲁肽+LPS组细胞相比较，LPS组细胞SP-A的mRNA和蛋白表达下降更加显著，差异均有显著统计学意义(P<0.05)，见图1和表2。

图1 MLE-12细胞SP-A表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 1 The RT-PCR and western blot results of SP-A in MLE-12 cells

分组SP-AmRNASP-AproteinTTF-1mRNATTF-1protein对照组0.93±0.040.87±0.060.98±0.050.95±0.03Lir+LPS组0.57±0.12①②0.52±0.08①②0.72±0.11①②0.68±0.13①②LPS组0.21±0.06①0.16±0.03①0.22±0.06①0.18±0.08①

注：与对照组相比较①P<0.05，与LPS组相比较②P<0.05

2.3 TTF-1 mRNA和蛋白的表达水平 在LPS (0.5μg/ml)干预12h后，对MLE-12细胞TTF-1 mRNA和蛋白的表达水平使用RT-PCR法和western blot法进行检测。与Control组相比较，在LPS干预12h后MLE-12细胞TTF-1 mRNA和蛋白表达均明显降低，差异均有显著统计学意义(P均<0.05)；且与利拉鲁肽+LPS组细胞相比较，LPS组细胞TTF-1的mRNA和蛋白表达下降更加显著，差异均有显著统计学意义(P<0.05)，见图2和表2。

图2 MLE-12细胞TTF-1表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 2 The RT-PCR and western blot results of TTF-1 in MLE-12 cells

3 讨论

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是呼吸和危重病医学科的常见疾病，据流行病学和临床研究证实在美国和英国每年新发病人数约为19万人，其死亡率高达35%～60%[18～21]。目前ARDS被定义为由包括脓毒血症休克、重症胰腺炎、重症肺炎、大面积烧伤和严重骨折等肺内和或肺外的多种严重疾病和危重状态导致的以肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞损伤为中心的失控的炎症反应[18～21]。肺上皮细胞保护是ARDS治疗的重要环节之一。

胰高糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1) 主要由肠道内L细胞合成和分泌，属于肠肽类激素(incretin)具有包括调节糖脂代谢、调节细胞分化和调控炎症反应等广泛的生物活性，利拉鲁肽作为GLP-1的拟似物目前已广泛应用于2型糖尿病的临床治疗[14～16]。研究发现肺上皮细胞表面存在GLP-1R的表达[22]。同时有研究指出GLP-1对内毒素(LPS)和卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠肺部炎症反应有显著的抑制作用[22]。同时发现GLP-1对晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products, AGEs)诱导的胰岛β细胞具有保护作用[23]。本实验中我们发现GLP-1拟似物利拉鲁肽呈时间依赖性的改善了LPS诱导状态下小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞活性。该结果表明在LPS诱导的损伤状态下利拉鲁肽对小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞具有保护作用。

肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成与分泌，在维持肺泡的稳定性和肺组织顺应性、调节肺泡表面液体平衡以及调节肺组织固有免疫和炎症反应过程中扮演着重要的角色[1～4]。研究发现ALI/ARDS时由于PS的合成和分泌明显下降，以及PS的消耗和丢失明显增加导致肺组织PS明显减少[8～11]。PS的减少与ALI/ARDS相关的肺顺应性下降、肺泡水肿液体清除障碍和氧合障碍密切相关[8～11]。PS作为一种大分子聚合物其化学成分较为复杂，主要包括括磷脂和蛋白两部分，其中表面活性物质相关蛋白(surfactant-associated protein, SP)主要由SP-A、SP-B、SP-C和SP-D四组成，其中SP-A含量最丰富[1～4]。SP-A在肺泡中的主要作用是帮助形成具有高度表面活性的管状髓鞘结构，有助于磷脂降低表面张力维持肺泡的稳定性和肺组织的顺应性[1～4]。研究还认为SP-A具有作为ALI/ARDS疾病严重程度指标的潜在可能[5～7]。进一步的研究发现上调PS成分的表达对ALI/ARDS具有保护作用[10,11]。我们使用RT-PCR和western blot法对MLE-12细胞SP-A的表达进行分析后发现，在LPS干预12h后，MLE-12细胞SP-A mRNA和蛋白表达均明显降低；但LPS组与利拉鲁肽+LPS组细胞相比较，LPS组细胞SP-A的mRNA和蛋白表达下降更加显著。该结果表明在LPS诱导的损伤状态下利拉鲁肽可以有效促进小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞SP-A的表达。研究表明甲状腺转录因子-1 (thyroid transcription factor, TTF-1)对SP-A的表达具有关键的调控作用[12,13,24]。Liu D等人研究发现SP-A启动子区域存在TTF-1结合位点，是SP-A基因的重要调控因子[24]。本实验中我们对TTF-1 mRNA和蛋白的表达使用RT-PCR和western blot进行检测后发现在LPS干预12h后，MLE-12细胞TTF-1 mRNA和蛋白表达均显著下降；但LPS组与利拉鲁肽+LPS组细胞相比较，LPS组细胞TTF-1的mRNA和蛋白表达水平下降更加明显。该结果表明在LPS诱导的损伤状态下利拉鲁肽可以有效促进小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞TTF-1的转录与合成。

4 结论

本实验结果表明，在LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮MLE-12细胞损伤状态下，GLP-1拟似物利拉鲁肽可通过促进TTF-1的表达上调SP-A的合成，并对Ⅱ型肺泡上皮细胞产生保护作用。但利拉鲁肽对调控TTF-1表达的分子机制仍需进一步研究和揭示。

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Liraglutide promotes LPS-induced surfactant protein-A expression by up-regulation of TTF-1 in MLE-12 cells

WANG Jie,MOU Jie,ZHANG Wenbin,etal

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TraditionalChineseMedicalHospitalofChongqing,Chongqing400011)

Objective To explore the value of GLP-1 analogue liraglutide in the regulation of surfactant protein-A (SP-A) expression in LPS-induced injury in type II murine alveolar epithelial MLE-12 cells, and its potential mechanism. Methods MLE-12 cells, a cell line derived from murine type II alveolar epithelial cells, were stimulated with LPS (0.5μg/ml) in the presence and absence of GLP-1 analogue liraglutide. Then, MTT was used to evaluate the cell viabilities at the corresponding time points (0h, 6h, 12h and 24h). After 12 hours of LPS stimulation, the mRNA and protein expression of SP-A and TTF-1 were measured by RT-PCR and western blot. Results The cell viabilities of MLE-12 cells were time-dependent reduced after LPS stimulation. And LPS-reduced MLE-12 cell viabilities were markedly attenuated by liraglutide at each corresponding time points. Then, after 12 hours of LPS stimulation, the mRNA and protein of SP-A and TTF-1 were significantly inhibited by TTF-1. However, LPS-induced down-regulation of SP-A and TTF-1 were largely abrogated by liraglutide in MLE-12 cells. Conclusion Our data suggestes that liraglutide could promotes LPS-induced surfactant protein-A (SP-A) expression possibly through up-regulation of TTF-1 in type II alveolar epithelial MLE-12 cells.

Glucagon-likepeptide1; Liraglutide; MLE-12 cells; Surfactant protein-A; Thyroid transcription factor

重庆市卫生和计生委科技项目(ZY201402030)

R 503; R 446.6

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.007

2014-11-03； 编辑： 陈舟贵)