雄激素联合5型磷酸二酯酶抑制剂治疗大鼠糖尿病性勃起功能障碍的研究

夏磊磊,王先进,许天源,秦 亮,张 祥,朱照伟,张小华,钟 山,张敏光,沈周俊

(上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海 200025)

·基础研究·

雄激素联合5型磷酸二酯酶抑制剂治疗大鼠糖尿病性勃起功能障碍的研究

夏磊磊,王先进,许天源,秦 亮,张 祥,朱照伟,张小华,钟 山,张敏光,沈周俊

(上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海 200025)

目的 建立糖尿病性勃起功能障碍(DMED)大鼠模型，评价雄激素联合5型磷酸二酯酶抑制剂对DMED的治疗作用。 方法 通过链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法建立DMED大鼠模型，造模成功4周后随机分为4组：DM组、DM补充睾酮组、DM补充西地那非组、DM补充睾酮联合西地那非组，正常大鼠作为对照组。给药6周后通过电刺激海绵体神经诱发勃起的方法测定各组大鼠的勃起功能，ELISA法测定各组大鼠的血清睾酮水平，HE染色和masson染色评价各组阴茎海绵体形态学改变，Western blot和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。 结果 DM大鼠较正常大鼠勃起功能显著下降，睾酮水平明显降低，eNOS表达降低，阴茎海绵体间质纤维化程度增加而平滑肌成分减少。睾酮补充治疗和长期西地那非治疗均可改善DMED大鼠的勃起功能和改善DMED大鼠阴茎的纤维化程度，睾酮和长期西地那非联合治疗改善效果最明显。 结论 DM大鼠的勃起功能明显降低，DMED发生的部分原因可能与雄激素水平降低有关，雄激素联合长期5型磷酸二酯酶抑制剂可明显改善DMED大鼠的勃起功能和阴茎纤维化程度。

糖尿病；勃起功能障碍；雄激素；磷酸二酯酶抑制剂

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是世界范围内的常见病，国内流行病学调查预计中国成人(大于18岁)DM患病率为11.6%，DM前期所占比例为50.1%[1]。DM是引起勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)的最重要器质性疾病，有报道表明DM患者ED的发生率为非DM患者的3倍(分别为49.3%和 15.6%)[2]。糖尿病性勃起功能障碍(diabetes mellitus erectile dysfunction，DMED)发病机制复杂，其中主要涉及因素包括内皮细胞损伤、神经病变、大血管病变、小血管病变以及雄激素水平的降低等[3]。

ED的一线治疗药物为5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5, PDE5)抑制剂，如西地那非、他达拉非等。与非DM性ED相比，DMED对PDE5抑制剂敏感性相对较差，部分原因可能与DM导致雄激素水平降低有关[4]。此外，临床试验及相关研究对于雄激素治疗DMED的报道结果不一致[5-6]。虽然也有一些动物研究表明长期小剂量PDE5抑制剂可改善DMED，但联合雄激素和长期PDE5抑制剂治疗的研究仍然较少[7-8]。本研究首先建立DMED大鼠模型，并在此模型基础上探讨雄激素联合长期PDE5抑制剂对DMED大鼠勃起功能的治疗作用，进而为临床用药提供一定指导。

1 资料与方法

1.1 实验动物及试剂 SPF级8周龄雄性SD大鼠100只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海交通大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心清洁级动物房独立通气笼盒系统，室温20 ℃～25 ℃，相对湿度40%～60%，光照和黑暗每12 h改变1次，标准饲料，自由饮水、摄食，常规饲养观察1周无异常后进行实验。实验鼠进入研究前由交配实验证实均有正常性功能。实验经过动物保护和使用委员会批准。

链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)购自于美国Sigma公司，溶液配制方法为1 g STZ在冰浴中溶解于100 mL的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 4.5)中，配成10 mg/mL终浓度，避光保存，即配即用。血糖仪及试纸购自罗氏公司。雄激素选用十一酸睾酮(testosterone undecanoate, T)注射液：250 mg/2 mL，购于浙江仙琚制药股份有限公司(批号：国药准字H10900063)。PDE5抑制剂西地那非(sildenafil, S)，购于美国辉瑞公司。大鼠睾酮ELISA试剂盒购于西塘生物科技公司。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗体购于美国Santa Cruz生物科技有限公司(批号：sc-654)。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型的建立及判断 100只SD雄性大鼠随机分为正常组(n=20)和造模组(n=80)。造模组禁食8～12 h后，腹腔一次性注射STZ(50 mg/kg)诱导DM模型，正常组注射相同剂量的柠檬酸钠缓冲液。在STZ注射后4 d用便携式血糖仪检测血糖，任意时间血糖>16.67 mmol/L为DM成模标准，剔除未达标准的大鼠(n=6)。

1.2.2 分组及给药 造模4周后，将DM大鼠重新随机分组。最终74只DM成模大鼠和20只正常大鼠分为5组，分别为正常组N(n=20)、DM组(n=19)、DM+T给药组(n=18)、DM+S给药组(n=18)、DM+T+S给药组(n=19)。分组完成后DM+T、DM+S、DM+T+S组给药治疗：其中S为灌胃给药，每天1次，给药量为5 mg/(kg·d)，持续6周；T为肌肉注射给药，2周1次，给药量为100 mg/(kg·次)，持续6周；所有未灌胃大鼠每天灌胃与S等量生理盐水，所有未肌肉注射大鼠2周肌肉注射与T等量生理盐水。

1.2.3 大鼠勃起功能的测定 参考本课题组既往的研究方法[9-10]。电刺激法测定勃起功能的主要过程为：①平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)测定：戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，颈部正中切口，暴露并切开左侧颈总动脉置入PE10管，直接法持续监测大鼠MAP；②阴茎海绵体内压(intracavernous pressure, ICP)测定：阴茎包皮纵行切口，左右两侧阴茎海绵体均置入22号针头，分别用于测定ICP和药物注射。上述PE10管和22号针头均通过PE50管与压力换能器相连，管内充满肝素钠注射液(250 U/mL)，与压力换能器相连的MPA2000多通道生物信号分析系统用于记录MAP和ICP；③海绵体神经(cavernous nerve, CN)电刺激：下腹部正中切口，于前列腺右侧叶前外侧表面暴露右侧CN，铂金双极电极钩起右侧CN，连接于电刺激器，对CN进行电刺激。电刺激参数电压、波宽、频率分别设置为：5 V、2 ms、25 Hz，每次刺激持续时间30～60 s；④结果记录：电刺激CN前的ICP记录为“基础ICP”(bICP)，相应的MAP记录为“基础MAP”(bMAP)，计算(bICP /bMAP)×100%代表阴茎海绵体静息状态。电刺激CN诱发的ICP最大值记录为“最大ICP”(mICP)，相应的MAP记录为“最大MAP”(mMAP)，计算(mICP /mMAP)×100%代表大鼠的勃起功能。本研究中每间隔5 min电刺激1次，共3次，结果取3次平均值作为每组大鼠的勃起功能值。

1.2.4 大鼠血清睾酮水平的测定 各组大鼠勃起功能测定结束后，心脏采血6～10 mL，3 000 r/min离心10 min取血清，按大鼠睾酮ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠的血清睾酮浓度。

1.2.5 大鼠阴茎海绵体形态学检测 各组大鼠取部分阴茎组织，冷生理盐水洗净，10% Bouin氏液溶液固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片厚4～5 μm，行HE染色和masson染色。HE染色和masson染色后光镜下观察，masson染色中，胶原纤维、黏液、软骨呈绿色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色，细胞核染蓝黑色。

1.2.6 大鼠阴茎海绵体eNOS表达水平检测 各组大鼠取部分阴茎海绵体组织，冷生理盐水洗净，液氮冻存。使用Western blot技术检测eNOS蛋白的表达，eNOS抗体的浓度为1∶200，以GAPDH作为内参。取前述切片行免疫组织化学检测eNOS表达，eNOS抗体的浓度为1∶50。

2 结 果

2.1 各组大鼠体重、阴茎重量、血糖及睾酮水平的比较 见表1。N组最终体重较初始体重增加，DM、DM+T、DM+S、DM+T+S组最终体重均较初始体重降低；DM、DM+T、DM+S、DM+T+S组最终体重与N组相比均有明显差异(P均<0.01)。DM、DM+S组阴茎重量均较N组明显降低(P均<0.01)；DM+T、DM+T+S组阴茎重量与N组无明显差异(P分别为0.404、0.278)。DM、DM+T、DM+S、DM+T+S组血糖均较N组血糖明显升高(P均<0.01)，DM、DM+T、DM+S、DM+T+S组间血糖无明显差异(P=0.772)。DM、DM+S组睾酮水平均较N组明显降低(P均<0.01)；补充T显著升高血清睾酮水平，DM+T、DM+T+S组睾酮水平均较N组有一定升高，但差异无统计学意义(P分别为0.290、0.389)；DM+T、DM+T+S组睾酮水平均较DM组有升高，差异有统计学意义(P均<0.01)；DM+T、DM+T+S组睾酮水平均较DM+S组有升高，差异有统计学意义(P均<0.01)。

表1 各组大鼠体重、血糖、阴茎重量及睾酮水平测定结果 ±s)

N：正常组；DM：糖尿病组；T：十一酸睾酮；S：西地那非。与正常组比较，*P<0.01；与DM组比较，△P<0.01；与DM+S组比较，#P<0.01。

2.2 各组大鼠勃起功能的比较 见图1。实验终点时，DM大鼠勃起功能较正常对照大鼠显著下降(P<0.01)；DM+T、DM+S和DM+T+S组大鼠勃起功能较DM组大鼠均明显提高(P均<0.01)；DM+T和DM+S组大鼠勃起功能均低于正常组大鼠(P均<0.01)，DM+T+S组大鼠勃起功能与正常大鼠相比差异无统计学意义(P=0.594)；5组间整体方差分析结果表明组间勃起功能差异显著(P<0.01)。

2.3 各组大鼠阴茎海绵体形态学检测结果 见图2。HE染色和masson染色结果显示：正常组大鼠海绵体血窦分布规则、均匀，海绵体平滑肌(masson染色为红色)丰富、排列规则；DM组大鼠阴茎较小，血窦数量减少、体积变小，间质成分(masson染色为绿色)增多；DM+T+S组大鼠接近正常；DM+T组和DM+S组大鼠情况介于正常组和DM组之间。

图1 各组勃起功能的比较

N：正常组；DM：糖尿病；T：十一酸睾酮；S：西地那非；**P<0.01。

图2 各组阴茎海绵体HE染色和masson染色结果

注：A1～E1：HE染色；A2～E2：masson染色；A1、A2：正常组；B1、B2：糖尿病组；C1、C2：糖尿病+睾酮组；D1、D2：糖尿病+西地那非组；E1、E2：糖尿病+睾酮+西地那非组；标尺=500 μm(×40)。

2.4 各组大鼠阴茎海绵体eNOS表达水平结果 结果见图3、图4。Western blot和免疫组织化学结果显示：与正常大鼠相比，DM和DM+S组大鼠阴茎海绵体eNOS表达量明显降低，DM+T组出现一定程度的改善，联合使用睾酮和西地那非组改善最明显，接近正常大鼠。

图3 各组eNOS表达免疫组织化学结果图

A：正常组；B：糖尿病组；C：糖尿病+睾酮组；D：糖尿病+西地那非组；E：糖尿病+睾酮+西地那非组。**P<0.01。

图4 各组Western blot结果

3 讨 论

本研究通过建立大鼠DM模型验证了DM大鼠的勃起功能显著下降，DM大鼠的阴茎纤维化程度增加，并发现雄激素和长期PDE5抑制剂治疗均可以不同程度地改善DMED大鼠的勃起功能和阴茎纤维化程度，而雄激素联合PDE5抑制剂改善效果更明显。DM造模采用STZ腹腔注射方法，STZ诱导的1型DM模型广泛应用于科学研究，腹腔注射数天后血糖即出现明显升高然后保持相对稳定。本研究模型采取50 mg/kg的STZ浓度，效果较好，未出现大鼠死亡的情况，其中有6只未成模剔除研究，总体成模率较高。我们的结果表明STZ诱导的DM大鼠勃起功能较正常大鼠显著降低， STZ诱导的DM模型本身即可以认为是一种DMED模型[7]。正因如此，我们采取在实验终点直接使用标准的电刺激法测定各组大鼠的勃起功能，电刺激法测定动物的勃起功能在国外应用较多，但在国内采用相对较少，这可能是由于该方法存在一定的技术难点，尤其是在分离海绵体神经和确立电刺激参数方面较难掌握。我们并没有采用阿扑吗啡实验进行大鼠勃起功能的测定或筛选，因为阿扑吗啡实验具有一定的主观性，易受环境因素的影响。

DM导致ED的机制复杂，其中研究的主要焦点为神经性因素和血管性因素，DM导致雄激素水平的降低也可能是发病原因之一[4, 11]。本研究结果表明STZ诱导的DM大鼠相对正常大鼠血清睾酮浓度明显下降，但是睾酮下降的原因可能并不单纯与血糖升高有关。STZ毒性较大，有研究表明STZ可能对睾丸Sertoli细胞具有直接损害作用，但是短期内对产生雄激素的Leydig细胞可能并无作用[12]。还有研究表明在胰岛素依赖性DM中，雄激素的缺乏可能与缺少胰岛素对Leydig细胞的直接刺激有关，同时胰岛素缺乏导致卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone, LH)的降低进而影响到下游性腺内分泌功能[13-14]。尽管雄激素降低原因还有待进一步阐明，但明确的是雄激素在维持阴茎海绵体勃起功能时具有重要作用，其中主要的作用靶点包括信号递质一氧化氮(nitric oxide, NO)、关键酶eNOS及PDE5[15]。我们的结果也间接表明了eNOS的表达可能受雄激素调控。此外，雄激素在维持阴茎海绵体结构方面具有重要作用，雄激素水平的降低可导致海绵体平滑肌细胞凋亡增加、细胞外基质和成纤维细胞的聚集[16]。本研究发现DM大鼠的血清睾酮浓度明显降低，而相应DM大鼠的阴茎海绵体平滑肌成分减少，纤维组织增多，纤维化程度增高；补充雄激素后(DM+T和DM+T+S组)大鼠阴茎的纤维化程度降低。临床上，雄激素补充治疗也在一定情况下应用于ED，尤其是伴有性腺功能低下的患者[17]。HACKETT等[6]报道的最大样本的随机对照临床试验表明，2型DM患者使用雄激素治疗30周后，治疗组相对安慰剂组勃起功能评分更高。但是最新的一项临床试验认为使用雄激素治疗2型DM患者并不能改善勃起功能[5]。两项临床试验对于雄激素治疗DMED结果不同，可能的原因是2型DM本身伴发的疾病很多，如肥胖、高血压、高脂血症甚至精神心理疾病如抑郁等，这些因素均会对勃起功能产生一定影响，进而影响试验结果[5-6]。我们的结果发现，DM大鼠补充雄激素后勃起功能明显改善，但仍不能达到正常大鼠的水平。此外，本实验结果表明雄激素补充治疗本身对血糖无明显影响。可能原因在于STZ诱导DM的机理在于破坏胰岛细胞导致胰岛素绝对缺乏，而睾酮并不能恢复胰岛素水平或修复胰岛细胞。这与有关临床试验报道睾酮补充可改善2型DM的血糖有一定差异，2型DM的主要问题在于胰岛素抵抗[6, 18-19]。

PDE5抑制剂被认为是药物治疗ED的首选，也广泛应用于DMED的治疗。但是临床试验表明DMED对PDE5抑制剂的反应性相对非DM引起的ED较差[20]。我们的研究结果也证实这一点，单纯使用PDE5抑制剂组与联合使用PDE5抑制剂和雄激素组相比，勃起功能改善的程度较低。PDE5抑制剂最主要的使用方式为按需使用，但是越来越多的临床研究表明长期小剂量PDE5抑制剂对于ED的治疗效果好，尤其适合难治性ED，包括DMED、严重血管性ED、根治性前列腺切除后ED等[21-26]。临床研究表明雄激素补充治疗可在一定程度恢复DM患者对PDE5抑制剂的敏感性[27]。从实验结果可以看出，雄激素和长期PDE5抑制剂均可以不同程度地改善DMED，而雄激素联合PDE5抑制剂改善效果最明显，可见雄激素和PDE5抑制剂有一定的协同作用。可能的原因在于雄激素的降低会导致勃起的关键酶eNOS和PDE5表达水平降低，补充雄激素一方面可直接改善勃起功能，另一方面增加PDE5的表达进而提高PDE5抑制剂的敏感性[28]。此外，雄激素具有的抗凋亡、抗炎、抗氧化应激效应和改善血管功能可能也起一定作用[29-31]。

值得指出，本研究属于动物实验研究，临床应用的可能性仍然需要仔细斟酌。第一，临床上对于DMED的治疗首先需要控制好血糖，在血糖控制良好的基础上若DMED改善不明显，才考虑下一步的药物治疗。第二，本实验模型为1型DM模型，而临床上主要为2型DM，2型DM伴发疾病很多，如肥胖、高脂血症、高血压等，上述伴发疾病本身就可以导致ED的发生，因此对于其他因素的干预也很重要。第三，雄激素在ED中的应用本身争议就较大，尤其是老年患者使用雄激素可能副作用也较大，激素水平在补充治疗前是重要的参考因素[15]。

总之，本研究发现DM大鼠的勃起功能明显降低、血清睾酮水平降低、阴茎纤维化程度增高。雄激素和长期PDE5抑制剂治疗均可改善DMED大鼠的勃起功能，而联合治疗效果更优，可为临床用药提供一定参考。但是临床治疗一定是以个体化治疗为准，我们只能推测对于伴性腺功能低下且对按需PDE5抑制剂不敏感的难治性DMED，雄激素补充和长期小剂量PDE5抑制剂可作为试验性治疗并观察具体疗效。

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(编辑 王 玮)

Androgen combined with phosphodiesterase type 5 inhibitor for the treatment of erectile dysfunction in diabetic rats

XIA Lei-lei, WANG Xian-jin, XU Tian-yuan, QIN Liang, ZHANG Xiang, ZHU Zhao-wei, ZHANG Xiao-hua, ZHONG Shan, ZHANG Min-guang, SHEN Zhou-jun

(Department of Urology, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

Objective To establish the rat model of diabetes mellitus erectile dysfunction (DMED) and evaluate the therapeutic effect of androgen combined with phosphodiesterase type 5 (PDE5) inhibitor. Methods DMED models were established by peritoneal injection of streptozotocin (STZ). Four weeks later the DMED rats were randomly divided into 4 groups: DM group, testosterone group, sildenafil group, and testosterone plus sildenafil group. Healthy rats served as controls. Six weeks after the initiation of treatments, the erectile function of each group was evaluated using electrostimulation of the cavernous nerve. The serum testosterone levels were determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The morphological changes of corpus cavernosum of penis were evaluated with hematoxylin-eosin staining and masson staining. The endothelial nitric oxide synthase (eNOS) level were determined with Western blot and immunohistochemistry. Results Compared with healthy rats, the erectile function, testosterone level and eNOS level of diabetic rats were significantly decreased. The smooth muscle cells of diabetic rats’ corpus cavernosum were reduced while extracellular matrix fibrosis was increased. Testosterone replacement and chronic sildenafil treatment could ameliorate erectile function and extracellular matrix fibrosis, and combined treatment with testosterone and sildenafil had the most significant effect. Conclusions The erectile function of DM rats is significantly impaired. The pathogenesis of DMED may be partly attributed to the low androgen level. Combined treatment of testosterone and sildenafil can significantly improve erectile function and extracellular matrix fibrosis of DMED rats.

diabetes mellitus; erectile dysfunction; androgen; phosphodiesterase inhibitor

2014-10-08

2015-01-25

国家自然科学基金面上项目(No. 81270695，81472379)

沈周俊，教授，主任医师，博士研究生导师．E-mail：shenzj6@sina.com

夏磊磊(1990-)，男(汉族)，硕士在读. 研究方向：泌尿外科，男科．E-mail：xll7188@126.com

R698.1

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.05.015