钩藤提取物对感染朊病毒酵母模型的治疗作用

张 艳，刘宴村，宋有涛，2＊

（1.辽宁省动物资源与疫病防治重点实验室／辽宁大学生命科学院，辽宁沈阳110036；2.辽宁大学环境学院，辽宁沈阳110036）

朊病毒［PSI＋］是一种只有蛋白质而没有核酸的传染因子 ，能在多物种间传播，其所致疾病为慢性、致死性、神经退行性传染病，致死率高达100%，主要包括疯牛病、绵羊瘙痒症和人克雅氏病等［1］。它具有两种不同的分子构象：一种是存在于正常机体中，没有致病作用，称为细胞朊蛋白（PrPC）；另一种是仅存在于感染动物的细胞中，称为朊病毒蛋白（PrPSc）。PrPSc是由PrPC发生错误折叠后形成的富含β折叠和具有抗蛋白酶水解特性的异常朊蛋白，两者具有相同的一级结构，且由同一个基因Prnp编码，但二极结构及高级结构则有着显著差异［2］。由于朊病毒的分子致病机制的复杂性，目前对朊病毒类疾病的治疗仍然缺乏有效的治疗方法［3］。

酵母中存在着和哺乳动物类似的朊病毒，具有与哺乳动物的类淀粉状纤维形成的分子伴侣体系和生物化学环境相似的特性［4］，Blondel M博士利用酵母细胞筛选方法筛选出了两种有效的抗酵母朊病毒的化合物，其中一种能有效对抗哺乳动物的朊病毒［5］。Bach S等［6］利用酵母朊病毒模型从一些天然药物中筛选出具有抗朊病毒的活性成分。研究表明，姜黄素、阿魏酸能抑制朊病毒的复制，两面针提取物可使酵母朊病毒聚集状态（白色）转变为可溶状态（红色）。从丹参中分离出的丹酚酸B，有抑制Aβ聚集作用且对神经具有保护作用，对与朊病毒致病机理相似的阿尔茨海默症具有潜在治疗作用［7-9］。本试验基于抗酵母朊病毒［PSI＋］药物筛选模型，以钩藤为研究对象，利用细胞表型试验和半变性琼脂糖凝胶电泳（semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis，SDD-AGE）结合蛋白印迹法［10-11］研究钩藤对朊病毒的影响，为今后深入研究中药成分治疗朊病毒疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：MATαkar1SUQ5ade2-1his3Δ202leu2Δ1 trp1Δ63ura3-52erg6：：KanMX，［PSI＋］由美国NIH的Masison D博士提供。

1.1.2 培养基 1／2YPD培养基：20g／L蛋白胨，5 g／L酵母浸出粉，20g／L葡萄糖，固体培养基需加20g／L琼脂粉，在115℃高压蒸汽灭菌25min。YPAD固体培养基：20g／L蛋白胨，00g／L酵母浸出粉，0.4g／L腺嘌呤，20g／L琼脂粉，20g／L葡萄糖，在115℃高压蒸汽灭菌25min。SD-Ade固体培养基：7g／L YNB-AA、20g／L琼脂粉、20g／L葡萄糖，在115℃高压蒸汽灭菌25min。倒平板前加入氨基酸：Ura 20mg／L，Trp 20mg／L，His 20mg／L，Leu 60mg／L。

1.1.3 主要药品与试剂 钩藤，购自辽宁省沈阳市国大药房产品；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂粉，北京索莱宝生物科技有限公司；腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸，北京市鼎国技术有限公司产品；羊抗sup35抗体与HRP标记的驴抗羊IgG，圣克鲁斯生物技术公司（美国）产品。

1.2 方法

1.2.1 钩藤水提取物的制备及酵母朊病毒［PSI＋］遗传表型分析 将钩藤茎粉碎，用蒸馏水在95℃条件下浸提提取3h，过滤离心，抽滤收集滤液，用滤液配制1／2YPD液体培养基，灭菌后备用。随机挑取3个～4个［PSI＋］酵母单菌落于10mL液体培养基中，在恒温水浴24℃震荡过夜活化后，检测菌液OD 600nm为0.2左右时，按100mL／L接种量接种到含有钩藤水提取物的1／2YPD液体培养基中，24℃震荡培养5d，每天及时更换新鲜培养液（含有钩藤水提物），5d后稀释培养液并涂布于1／2YPD固体平板，平板于24℃培养箱中培养5d～7d，观察菌落颜色变化并记录［12］。

1.2.2 钩藤醇提取物的制备及酵母朊病毒［PSI＋］遗传表型分析 将钩藤茎粉碎，称取10g加入100 mL的750mL／L乙醇在95℃水浴中回流提取2h，重复3次，合并提取液，56℃减压蒸发浓缩，然后60℃烘干至恒重，用5%DMSO（二甲基亚枫）溶解使提取液浓度为200g／L［13-14］。随机挑取［PSI＋］酵母细胞在24℃过夜活化培养后，调整菌液OD 600nm为0.2左右，按100mL／L接种量分别接种到含有不同浓度钩藤醇提取物的1／2YPD液体培养基中，在24℃恒温振荡培养，每天更换新的液体培养基和钩藤醇提取物；分别在1、3、5d取药物混合培养液稀释后涂布于1／2YPD固体平板，将平板置于24℃恒温培养箱中培养5d～7d后，观察是否出现红色菌落并记录［14］。

1.2.3 影印培养法检测钩藤醇提物对酵母朊病毒细胞的治疗作用 为了排除钩藤醇提物治疗感染朊病毒酵母细胞的假阳性可能，本试验利用影印培养法随机挑取钩藤醇提取物治疗的红色菌落划线于1／2YPD平板上于30℃培养1d后，分别影印到SD-Ade、1／2YPD和YPAD固体培养基上，24℃培养5d，记录菌落生长情况。

1.2.4 SDD-AGE／Western blot在蛋白水平检测钩藤醇提取对酵母朊病毒细胞的治疗作用 随机挑取3个～4个白色菌株和被钩藤醇提取治疗的红色菌株，分别接种到YPD液体培养基中，在30℃下振荡培养约14h～16h进行活化，按20mL／L的接种量进行扩大培养，检测菌液OD 600nm为1.5左右时停止培养，离心收集细胞，加入裂解缓冲液，用珠磨仪进行细胞破碎，离心收集上清得到蛋白样品；进行15g／L的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在0℃、恒流0.35A条件下转膜1h，将蛋白转印到PVDF膜上，加入羊抗Sup35抗体（一抗）孵育1h，4℃冰箱过夜后洗膜，加入HRP标记的驴抗羊IgG（二抗）孵育1h后，洗膜，采用ECL发光试剂盒对其进行放射自显影检测，保存图像信息。

2 结果

2.1 钩藤水提取物和醇提取物对酵母朊病毒［PSI＋］的作用效果

钩藤水提取物作用于感染朊病毒［PSI＋］的酵母细胞5d后，涂板24℃恒温培养7d后，可以观察到没有红色菌落出现（图1），说明钩藤水提物对朊病毒［PSI＋］酵母细胞没有治疗效果。钩藤醇提物作用于感染朊病毒［PSI＋］的酵母细胞5d后，有红色菌落出现（图2），说明钩藤醇提取物对朊病毒［PSI＋］酵母细胞有一定的治疗作用。

图1 钩藤水提取物对酵母朊病毒［PSI＋］模型的治疗效果Fig.1 Effect of aqueous extract from uncaria on yeast prion［PSI＋ ］

2.2 影印培养法检测钩藤醇提取物对酵母朊病毒［PSI＋］模型的治疗效果

将钩藤醇提取物治疗的酵母红色细胞影印在1／2YPD培养基上显示为红色菌落，在YPAD培养基上显示为白色菌落，而在SD-Ade的培养基上不生长（图3），因为治愈的［PSI-］细胞不能合成腺嘌呤。因此，在表型水平上进一步验证钩藤醇提取物对酵母朊病毒有一定的治疗作用。

2.3 蛋白水平分析钩藤醇提取对酵母病毒［PSI＋］的作用效果

为了更全面分析钩藤醇提取物对酵母病毒［PSI＋］的作用效果，弥补表型分析所带来的假阳性和假阴性的干扰，我们采用SDD-AGE／Western blot技术，比较不同菌株中Sup35p蛋白的聚集状态。传统的SDS-PAGE只能定性检测朊病毒能否发生聚集，不能定量分析聚合体的大小和聚集状态。而聚合体的大小正是在研究朊病毒的传播及繁殖的一个十分重要的性质。

如图4所示，在［PSI＋］细胞朊病毒Sup35p蛋白主要以聚集体形式存在，而在［PSI-］细胞中，Sup35p主要以单体形式存在。钩藤醇提物作用酵母朊病毒［PSI＋］细胞5d后的红色菌落，细胞内Sup35p蛋白出现了单体和少量聚集体，其聚集体远远少于［PSI＋］，经过3次重复试验，说明钩藤醇提取物对酵母朊病毒［PSI＋］模型有一定的治疗效果。

图2 钩藤醇提物对酵母朊病毒［PSI＋］模型的治疗效果Fig.2 Curative effect of alcohol extracts of uncaria on yeast［PSI＋ ］prion

图3 利用影印培养法检测钩藤醇提物的治疗效果Fig.3 The curing effects of alcohol extracts of uncaria on yeast［PSI＋］prion detectionby replica plating

图4 SDD-AGE／westren blot分析钩藤醇提取物对酵母阮病毒［PSI＋］的影响Fig.4 Effects of alcohol extracts of uncaria analyzed on yeast［PSI＋］prion by SDD-AGE／Western blot

3 讨论

钩藤是我国传统中药，为茜草科钩藤属植物，其带钩茎枝入药，性凉味苦甘，具有清热平肝、熄风定惊的作用。现代药理研究表明，钩藤具有显著的降压、抗心律失常、镇静和治疗老年痴呆症等功效［15］。钩藤有效成分为吲哚类生物碱，主要包括钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱和异去氢钩藤碱等，其中钩藤碱含量最高，为主要有效成分。有文献表明石杉碱甲是从草药千层塔中分离得到的一种石松类生物碱，作为乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病、血管性痴呆、良性记忆障碍等已有超过16年的临床应用经验［16］。据报道，钩藤碱具有显著的抑制Aβ纤维生成的作用，以抑制Aβ的生成是治疗阿兹海默症的有效策略［17］。阿尔茨海默症和帕金森病等与朊病毒疾病发病机理相似的疾病，所以推测钩藤中的生物碱有抗酵母阮病毒的作用，本实验室使用抗酵母朊病毒药物筛选平台，在细胞表型和蛋白水平分析了钩藤醇提取物抗朊病毒作用。在［PSI＋］细胞中，大多数的Sup35p聚集成纤维状，导致无义突变抑制，产生终止密码子通读现象，合成腺嘌呤，能在缺乏腺嘌呤的培养基上生长为白色菌落；在［PSI-］细胞中，Sup35p呈可溶的单体，需要在含有腺嘌呤的培养基上生长，如果菌株在酵母浸粉／葡萄糖／蛋白胨的培养基，细胞由于生物合成途径被阻断导致红色中间产物积累而形成红色菌落，这个表型系统可通过颜色辨别［PSI＋］的方法，初步分析药物对［PSI＋］表型的治疗效果［18］。研究结果表明，钩藤水提取物处理的酵母朊病毒［PSI＋］模型在表型上为白色菌落，蛋白水平上为聚集体状态，表明无治疗效果，而钩藤醇提物处理的酵母朊病毒［PSI＋］模型为红色菌落，在蛋白水平上显示一定的治疗作用，由此可知，钩藤中含有抗酵母朊病毒的成分，而且它存在于醇提取物中。这将对抗朊病毒有效药物的开发具有重要意义。

［1］王辉暖，陈伯安，周向梅，等.朊病毒感染途径的研究进展［J］.实验动物科学，2012，29（2）：58-63.

［2］徐利楠，于媛媛，沈曼莉，等.氯化钠对朊病毒结构稳定性影响的分子动力学研究［J］.分子科学学报，2012，28（4）：275-279.

［3］Wagner J，Ryazanov S，Leonov A，et al.Anle138b：a novel oligomer modulator for disease-modifying therapy of neurodegenerative diseases such as prion and Parkinson＇s disease［J］.Acta Neuropathol，2013，125（6）：795-813.

［4］宋有涛，吴宪远，何星蓉.抗朊病毒药物筛选模型的研究进展［J］.辽宁大学学报，2010，37（4）：289-293.

［5］Song Y T，Song Y，Zhong Z，et al.Illuminating precise quantification in yeast-based model for antiprion compounds screening［J］.CMBB，2010，978（1）：296-299.

［6］Bach S，Tribouillard D，Talarek N，et al.A yeast-based assay to isolate drugs active against mammalian prions［J］.Methods，2006，39（1）：72-77.

［7］Durairajan S S K，Yuan Q，Xie L，et al.Salvianolic acid B inhibits Aβfibril formation and disaggregates preformed fibrils and protects against Aβ-induced cytotoxicty［J］.Neuro Chem Inter，2008，52（4）：741-750.

［8］白换力，张海雷，鞠传静，等.阿魏酸抑制朊病毒复制作用的研究［J］.中国人兽共患病学报，2013，29（12）：1196-1202.

［9］钟正伟.两面针水提物对酵母朊病毒作用研究［J］.动物医学进展，2013，34（4）：133-136.

［10］钟正伟.一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术的改良［J］.广州化工，2012，40（12）：77-79.

［11］Kabani M，Redeker V，Melki R.A role for the proteasome in the turnover of Sup35p and in［PSI＋］prion propagation［J］.Mol Microbiol，2014，92（3）：507-528.

［12］李 辉，卜祥龙，窦 爽，等.淫羊藿提取物对酵母朊病毒［PSI＋］治愈的影响［J］.微生物杂志，2013，33（5）：42-45.

［13］窦 月，周洪雷，蔡梅超，等.钩藤总生物碱提取工艺研究［J］.辽宁中医杂志，2011，38（5）：344-344.

［14］刘宴村，李 辉，张 艳，等.定量研究石斛醇提取物对酵母朊病毒的治愈作用［J］.生命科学研究，2014，18（4）：344-348.

［15］刘 明，汤建林，胡岚岚，等.中药钩藤中钩藤碱含量的测定［J］.第三军医大学学报，2012，42（14）：1539-1541.

［16］王怀荟，刘万卉，孙 雯.石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的临床研究现状［J］.中国新药杂志，2011，20（11）：993-998.

［17］杨 卉.中药提取物治疗阿尔茨海默病的研究进展［J］.湖北中医药大学学报，2014，16（1）：113-115.

［18］王莉洁.Cl-／SO42-的金属盐胁迫诱导酵母朊病毒［PSI＋］形成的研究［D］.辽宁沈阳：辽宁大学，2012.