岩高兰分泌组织显微结构特征及其挥发性成分分析

孔凡丽，包海鹰

（吉林农业大学 中药材学院，长春130118）

岩高兰（EmpetrumnigrumL.var.japonicumK.Koch）是岩高兰科岩高兰属植物，在中国分布范围狭窄，仅产于大兴安岭海拔较高的山顶［1－4］。目前有关岩高兰药用方面的研究较少。对其化学成分和药理活性方面，国内仅有李春燕［5］报道了东北岩高兰对大鼠酒精性脂肪肝的预防有很好的作用。有关岩高兰挥发油成分分析的研究尚未见报道。本研究采用光学显微镜、扫描电镜观察研究岩高兰茎、叶表面和断面及分泌组织特征，采用3种不同的方法提取岩高兰挥发性成分，通过GC－MS法分析岩高兰挥发性成分，为更好开发利用该资源提供依据。

1 实验材料与仪器及试剂

1.1 实验材料

岩高兰采自内蒙古大兴安岭，由吉林农业大学菌物所包海鹰教授及图力古尔教授鉴定并提供。

1.2 实验试剂

石油醚（分析纯A.R）、蒸馏水。

1.3 实验仪器

扫描 电 子 显 微 镜（SSX－50 型）、光 学 显 微 镜（Nikon）、载玻片、盖玻片、显微照相机、粉碎机、手术刀、GC－MS联用仪、电子天平、循环水真空泵SHZ－D（Ⅲ）、旋转蒸发器RE－52AA、数显恒温水浴锅（HH－4型）、电热恒温鼓风干燥箱（DGX－9143BC－1型）。

2 实验方法

2.1 岩高兰组织结构显微观察

取岩高兰茎和叶，进行徒手切片、粉末制片，选取合适切片在光学显微镜下对该植物表面和断面特征进行观察描述［6］。扫描电镜样品选取茎横切面、叶上表面和下表面并用双面胶带纸粘于样品台上，喷金后于SSX－50 扫描电子显微镜下观察，通过WD－5扫描电镜联机图像分析系统，在100～20 000倍下数码拍照，电脑保存。

2.2 岩高兰挥发性成分的3种提取方法

2.2.1 水蒸气蒸馏法（SD）提取岩高兰挥发性成分［7－9］岩高兰粉碎后，过20目筛，精密称量100g放入1 000mL圆底烧瓶，加入500mL 蒸馏水及沸石蒸馏6h以上，直至挥发油提取完全，收集精油得淡黄色液体，并用无水硫酸钠干燥。

2.2.2 溶剂提取法－水蒸气蒸馏法（SX－SD）提取岩高兰挥发性成分 岩高兰粉碎后，过20目筛，精密称量200g放入1 500mL圆底烧瓶，加入适量石油醚回流提取8h，提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，再加入蒸馏水及数十粒沸石进行蒸馏，6h后收集精油并用无水硫酸钠干燥，得淡黄色油状物。

2.2.3 溶剂提取法（SX）提取岩高兰挥发性成分 将岩高兰粉碎后，过20 目筛，精密称量50g 放入500mL圆底烧瓶，加入适量石油醚回流提取8h，提取3次，合并提取液，减压浓缩得黄绿色浸膏。用此方法分别提取岩高兰茎、叶两个部位，减压浓缩后茎呈橘红色，叶呈黄绿色浸膏［10］。

2.3 GC－MS条件

2.3.1 气相色谱条件 DB25弹性石英毛细管柱30m×250μm×0.25μm，初始柱温50℃，在50℃保持3 min，再以10 ℃／min 升温至280 ℃，并在280 ℃保持10 min，进样口温度260 ℃，载气为氦气，载气流量1.0mL／min，分流比40∶1。

2.3.2 质谱条件 EI离子源，电子能量70eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，四级杆150 ℃，扫描质量范围20～500，电子倍增电压1 300V。

3 实验结果

3.1 岩高兰茎组织显微结构特征

3.1.1 岩高兰茎横切面显微结构 茎横切后经水合氯醛透化在光镜下观察（图版Ⅰ，1、2）发现茎切面呈圆形，表皮细胞为矩形呈无色透明状，细胞排列紧密，无细胞间隙，彼此紧密嵌合。木栓层为2～3列扁平状细胞，由木栓形成层和栓内层共同组成，木栓层细胞颜色较深，呈黄棕色，韧皮部由4～5列细胞组成。形成层为2～3列扁平状细胞构成，形成层环明显，木质部可见导管，周围由木纤维连接，木射线呈放射状分布，较密集，髓部薄壁细胞呈五边形或方形，中央有油细胞，较明显，呈浅黄色。

采用扫描电镜观察（图版Ⅰ，3、4）可以清晰的看见木质部的导管和纤维组织，髓部呈类方形，中间含有油细胞，如图片中颜色深的部位。

3.1.2 茎粉末 黄褐色，气味略香，木纤维呈束状，宽3～5μm，长135～282μm，导管直径5～24μm，长21～36μm；木栓细胞多呈长方形，长24.42～39.07μm，宽12～24μm，髓部油细胞，直径为9.73～19.47μm（图版Ⅰ，5～7）。

3.2 岩高兰叶组织显微结构特征

3.2.1 岩高兰叶片的横切面结构特征 叶片横切面的光学显微镜观察结果（图版Ⅰ，8）显示为扁圆形，有角质层，角质层外长有头状腺毛，头状腺毛由1个基细胞、1～3个柄细胞、1～4个头部细胞组成；叶缘有非腺毛，排列紧密并向内弯卷，无头部和柄部之分，由单细胞构成，最为明显的是头状腺毛含有挥发油，非腺毛则没有。有栅栏组织、海绵组织、气孔，导管为螺纹导管（图版Ⅰ，9～14），叶脉较粗为中脉。

3.2.2 叶粉末 粉末黄绿色，有香味，在光学显微镜观察显示表皮细胞为不规则形状，气孔直径约17 μm，上表皮头状腺毛宽9～12μm，长15～24μm，下表皮头状腺毛宽10～14μm，长29～71μm，非腺毛宽4～9μm，长48～109μm。

3.2.3 岩高兰叶片的上表面结构特征 叶上表面特征在扫面电镜下观察（图版Ⅱ，1～3）发现有较多头状腺毛，由于叶片失去较多水分，并在高电压下，头状腺毛的头部略不完整，叶片干瘪，叶缘反卷缝隙处有较多非腺毛（图版Ⅱ，4、5）。

3.2.4 岩高兰叶片的下表面结构特征 叶下表面特征在扫面电镜下观察发现由于叶缘向内反卷，从而形成两个管腔（图版Ⅱ，6、7），管腔内有油状光泽，分布较多头状腺毛，叶下表面的分布密度均大于上表面分布密度（图版Ⅱ，8、9）。

3.3 岩高兰出油率的比较

3种不同方法提取挥发油提取率也不同（表1），100g岩高兰全株经水蒸气蒸馏提取6h，收集挥发油，油样呈淡黄色透明液体，平均得率为0.47%。溶剂提取法－水蒸气蒸馏法提取挥发油，得到淡黄色挥发油，平均得率约0.35%。溶剂提取法提取8h，提取3次，浸膏为黄绿色油状物，平均得率为10.5%。溶剂提取法提取茎、叶，浸膏呈橘红色和黄绿色，得率分别为4.78%、6.1%。

3.4 岩高兰挥发油的化学成分分析及其比较

按上述GC－MS实验条件进样，得到3种不同方法提取岩高兰挥发油的总离子流图（图1～3），以及不同提取部位挥发油的总离子流图（图4～5），通过工作站对总离子流图进行处理，计算机标准谱库（Nist08）质谱数据库检索，峰面积归一化法确定了各个组分的百分含量，分别用3种方法分离出46、29、53个化合物，鉴定出41、25、46种。所鉴定化合物相对含量分别占挥发油总量的97.894%、95.384%、98.555%，各个组分的化学名称、百分含量见表2。从岩高兰茎、叶的挥发油中分离出了31、38个化合物，鉴定出27、32种，所鉴定化合物相对含量分别占挥发油总量的99.465%、96.543%，结果见表3。

表1 不同提取工艺的挥发油得率Table1 The yield of the volatile oils extracted by different technologies（V／W，%）

图1 水蒸汽蒸馏法挥发油总离子流图Fig.1 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in steam distillation

图2 石油醚提取法－水蒸气蒸馏法挥发油总离子流图Fig.2 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in solvent extraction and steam distillation

图3 石油醚提取法挥发油总离子流图Fig.3 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in solvent extraction

图4 茎挥发油总离子流图Fig.4 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in stem

图5 叶挥发油总离子流图Fig.5 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in leaf

表2 3种不同方法提取挥发油的化学组成及相对含量Table2 The chemical composition of the volatile oil content and relative content with 3different extracting methods

续表2 Continued Table 2

表3 岩高兰茎、叶挥发油的化学组成及相对含量Table3 The volatile oil chemical composition and relative content in stems and leaves of E.nigrum

续表3 Continued Table 3

4 讨 论

通过光学显微镜和扫描电镜下观察，除被子植物基本特征外，岩高兰的分泌组织是岩高兰的主要特征并与挥发性成分含量有着密切的关系，目前，许多学者采用了不同的方法和技术对植物分泌结构的起源和发生方式 做 了大量研究［11－14］，如Liang等［15］运用电镜酶细胞化学技术和方法发现柑橘属植物的分泌腔发生方式为裂溶生式。本研究通过对岩高兰茎、叶表面、断面的观察可知岩高兰的分泌组织有腺毛和分泌细胞，分泌组织多分布在茎的髓部以及叶上下表面腺毛中，腺毛数目和叶子的大小呈正相关，即叶片越大，毛的总数越多，而上下表面毛的密度则有很大差距，下表面明显多于上表面。分泌组织能分泌出有香气的芳香油，通过代谢途径扩散到空气里，使植株产生香味，通过对茎和叶粉末气味进行鉴别，叶的气味与原植物相近，初步推断香气是由叶片分泌组织产生，由于光学显微镜和扫描电镜的局限性对岩高兰分泌组织的超微结构与挥发油合成和含量变化规律需要进行进一步的研究。对岩高兰挥发性成分进行GC－MS分析并比较，结果表明，从方法上来看，用不同的方法提取岩高兰挥发油的效果不一样，水蒸气蒸馏法、溶剂提取法－水蒸气蒸馏法提取的挥发油颜色较浅杂质少，气味与原植株散发香气接近，但得率较小，而溶剂回流提取挥发油得率较高，所含杂质也较多。从化学成分上看，对3种提取方法的化学成分进行比较，水蒸气蒸馏法含量超过1.5%共有14 个，相对含量较高的有：水杨酸苄酯（35.491%）、D－杜 松 烯 （7.402%）、芳 樟 醇（4.785%）；溶剂回流－水蒸气蒸馏法含量超过1.5%的共有25 个，相对含量较高的有：十六烷（7.831%）、γ－毕澄茄烯（7.302%）、α－衣兰油烯（5.698%）。溶剂提取法含量超过1.5%的共有15个，相对含量较高的有：根皮素（11.852%）、正三十四烷（11.433%）、无羁萜（11.765%）。三者共有化合物有2种，分别是顺－α，α－5－三甲基－5－乙烯基四氢化呋喃－2－甲醇、植酮，前者化学性质未曾报道，后者可用作维生素E 醋酸酯的中间体。从不同部位来看，岩高兰茎、叶挥发油主要为烷烃类以及少量的酸、酯、醇、醛、萘等化合物。从二者挥发油中共鉴定出43种化学成分，其中15种成分为两者共有，除三十四烷、二十九烷等烷烃类所占含量最高，其余大部分成分为具有芳香气味的香精香料成分，如棕榈酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、角鲨烯等，但不同部位其共有成分含量有差异。

通过显微观察岩高兰组织特征，GC－MS法分析比较挥发性成分，分泌组织与岩高兰香气物质产生密切相关，其分泌物的组成和含量对香气有重要影响，正是这些有芳香气味的化学成分的有机结合以及自身生长的环境因素才形成了岩高兰的特征香味，也为资源开发与研究提供了很多有利途径。

图版Ⅰ 岩高兰茎、叶显微结构PlateⅠ The stem and leaf microstructure of E.nigrum

图版Ⅱ 岩高兰叶显微结构（电镜下）PlateⅡ The leaf microstructure of E.nigrum （scanning electron microscope）

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