T2DM患者外周血单个核细胞中NLRP3-mRNA表达与并发颈动脉粥样硬化的相关性研究

谢海龙　李俊立　万靖　李承彬

T2DM患者外周血单个核细胞中NLRP3-mRNA表达与并发颈动脉粥样硬化的相关性研究

谢海龙李俊立万靖李承彬

作者单位：434020荆州市，长江大学研究生院医学院（谢海龙）
434020荆州市，荆州市中心医院检验科（李俊立万靖李承彬）

目的研究炎性小体中含热蛋白结构域3的NOD样受体（NLR family，pyrin domain containing 3，NLRP3）在2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM）合并颈动脉粥样硬化 （carotid artery atherosclerosis，CAS）患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表达水平及其与疾病发生和发展的相关性。方法收集2013年6月至12月期间于我院就诊的T2DM患者107例、单纯CAS患者35例和健康体检者35例；其中T2DM患者根据CAS斑块情况分为单纯T2DM组26例、T2DM轻度斑块组32例、T2DM中度斑块组38例、T2DM重度斑块组11例。采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测各组患者PBMCs中NLRP3-mRNA的表达水平，并对检测结果进行统计学分析。结果正常对照组、单纯T2DM组、T2DM合并CAS组、单纯CAS组中NLRP3-mRNA的相对表达量差异有统计学意义（P＜0.01）。单纯T2DM组、T2DM合并CAS组、单纯CAS组中NLRP3-mRNA的相对表达量均高于正常对照组，且差异均有统计学意义（P均＜0.05）；T2DM合并CAS组中NLRP3-mRNA的相对表达量高于单纯T2DM组和单纯CAS组，且差异均有统计学意义（P均＜0.05）。在T2DM合并CAS各组中NLRP3-mRNA的相对表达量差异有统计学意义 （P＜0.01）。T2DM中度和重度斑块组中NLRP3-mRNA的相对表达量均低于T2DM轻度斑块组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。T2DM合并CAS组中NLRP3-mRNA的相对表达量与斑块成熟程度呈负相关（r=-0.70，P＜0.01）。结论NLRP3-mRNA与T2DM合并CAS的发生和发展密切相关。

NLRP3；外周血单个核细胞；颈动脉粥样硬化；2型糖尿病；实时荧光定量PCR

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.01.004

炎性小体中含热蛋白结构域3的NOD样受体（NLR family，pyrin domain containing 3，NLRP3）是NLR家族的一员，也是研究最为广泛的基因之一［1］。NLRP3可被多种刺激物质激活，如胆固醇晶体、活性氧等［2］。活化后的NLRP3触发NLRP3炎性小体装配形成一个大分子复合物，控制半胱天冬酶1 （caspase-1）的活性，并随后产生具有生物活性的IL-1β，引起无菌性炎性反应，介导炎症的发生和发展［3］。而炎性学说是关于动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发生发展的学说之一，也是引发2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者心血管病变的学说之一［4，5］。本文研究通过检测T2DM合并颈动脉粥样硬化（carotid artery atherosclerosis，CAS）患者外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中NLRP3-mRNA的表达水平，探讨NLRP3基因与T2DM并发CAS的相关性，现将结果报道如下。

1　资料与方法

1．1临床资料收集2013年6月至2013年12月期间于我院就诊的T2DM患者107例，根据华盛顿大学CAS斑块的超声分级标准将其分为无斑块的单纯T2DM组（n=26）和有斑块的T2DM合并CAS组（n=81），后者又分为Ⅰ级，单侧斑块≤2.0 mm的T2DM轻度斑块组（n=32）；Ⅱ级，单侧斑块＞2.0 mm或双侧均有斑块且其中至少一侧斑块≤2.0 mm的T2DM中度斑块组（n=38）；Ⅲ级，双侧斑块均＞2.0 mm的T2DM重度斑块组（n=11）。选择同期在我院就诊的无T2DM的CAS患者作为单纯CAS组 （n= 35）。另选择健康体检者作为正常对照组（n=35）。各病例组除符合诊断标准外，排除cryopyrin相关周期热综合征、痛风、阿尔茨海默症等炎性疾病。各组受试者间年龄、性别经平衡性检验，差异均无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。

1．2主要仪器与试剂ABI 7300荧光定量PCR仪（美国 ABI公司）、GENIUS原位 PCR仪 （英国Techne公司）、Auagra冷冻高速离心机（贝克曼库尔特公司）、TDZ5-WS离心机（中国长沙湘智离心机仪器有限公司）、DW-40L188低温保温箱（中国青岛海尔集团）、MINI-6K微型离心机（中国珠海黑马医学仪器有限公司）、UV-1700紫外分光光度计（岛津制作所）、PAC3000高压电泳仪（伯乐公司）、XW-80漩涡混匀器（中国上海医大仪器厂）和IE33多普勒彩色超声诊断仪（飞利浦公司）。淋巴细胞分离液由北京Solarbio Science公司提供，TRIzon总RNA提取试剂由美国life technologies公司提供，HIFI-MMLV cDNA第一链合成试剂盒与GoidStar TaqMan Mixture（with ROX）试剂盒由北京康为世纪生物科技有限公司提供。

1．3方法

1．3．1引物设计与合成参考文献［6］的内容，在GenBank中搜索人类NLRP3基因序列和人类βactin基因序列，使用primer express v2.0设计引物及探针，由美国life technologies公司合成。NLRP3上游：5＇-TGCCCGTCTGGGTGAGA-3＇，浓度为10 μM，下游：5＇-CCGGTGCTCCTTGATGAGA-3＇，浓度为10 μM；探针：5＇-（FAM）TGAGCCTCAACAAACGCTACACACGACT（DAB）-3＇，浓度为10 μM。β-actin上游：5＇-GCTGTCTGCCTTGGTAGTGGAT-3＇，浓度为10 μM，下游：5＇-GCATCGTCACCACCAAAGC-3＇，浓度为10 μM；探针：5＇-（FAM）ATGGGTCAGGGATGTGCAAGGCA（DAB）-3＇，浓度为10μM。

1．3．2总RNA的提取与逆转录每2 ml全血加2 ml生理盐水，混匀后加2 ml淋巴细胞分离液，取PBMCs，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，20 μl DEPC水溶解，通过OD260/OD280鉴定RNA的纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，均符合要求后按试剂盒操作说明进行逆转录反应。20 μl反应体系包含2.5 mM dNTP Mix Each 4 μl，Primer Mix 2 μl，5× RT Buffer 4 μl，0.1 M DTT 2 μl，200 U/μL HIFI-MMLV 1 μl，RNase-free water 2 μl，模板5 μl。反应条件：42℃50 min、85℃5min。产物-20℃保存备用。

1．3．3实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）检测依据参考文献［7］所描述的方法，优化后进行RT-FQ-PCR检测。20 μl反应体系包含2×Glodstar Taqman Mixture 10 μl，上下游引物及探针各1 μl，逆转录产物5 μl，加入RNase－Free water至20 μl；反应条件：95℃预变性10 min，95℃30 s，56℃30 s，62℃45 s，10个循环，然后95℃15 s，56℃15 s，62 ℃45 s，30个循环。所有标本均做双份检测，取均值统计数据，采用双德尔塔法计算目的基因的相对表达量，即以对照组表达量为参照进行计算，公式如下△△Ct＝（患者目的基因Ct－管家基因Ct）－（对照组目的基因Ct－管家基因Ct）患者组相对表达量＝2－△△Ct

1．4统计学处理采用SPSS 18．0统计软件处理数据，计量资料采用x±s表示，多组间计量资料的比较采用方差分析，NLRP3－mRNA相对表达量与斑块成熟度的相关性分析采用Pearson相关性分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1各组间NLRP3－mRNA相对表达量检测结果比较各组间NLRP3－mRNA的相对表达量差异有统计学意义（P＜0．01）。单纯T2DM组、T2DM合并CAS组以及单纯CAS组中NLRP3－mRNA的相对表达量均高于正常对照组，且差异均具有统计学意义（P均＜0．05）；T2DM合并CAS组中NLRP3－mRNA相对表达量高于单纯T2DM组和单纯CAS组，差异均有统计学意义（P均＜0．05）；单纯T2DM组NLRP3－mRNA相对表达量与单纯CAS组比较，差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

表1　各组间NLRP3－mRNA相对表达量检测结果比较

表1　各组间NLRP3－mRNA相对表达量检测结果比较

注：＊与正常对照组比较，P＜0．05；○与T2DM合并CAS组比较，P＜0．05

组别　例数　N L R P 3 －m R N A相对表达量正常对照组　35　1．00±0．08单纯T 2 D M组　26　1．70±0．76＊○T 2 D M合并C A S组　81　3．35±0．34＊单纯C A S组　35　1．31±0．32＊○F 值P值－－4 0 3 ．1 6 ＜0 ．0 1

2．2在T2DM合并CAS各组间NLRP3－mRNA相对表达量检测结果比较三组间NLRP3－mRNA相对表达量差异有统计学意义（P＜0．01）。T2DM轻度斑块组的NLRP3－mRNA相对表达量高于中度和重度组，且差异均有统计学意义（P均＜0．05）。T2DM中度和重度斑块组间NLRP3－mRNA的相对表达量差异无统计学意义（P＞0．05），见表2。

2．3T2DM合并CAS组NLRP3－mRNA相对表达量与斑块成熟度的相关性分析Pearson相关性分析结果显示，T2DM合并CAS患者NLRP3－mRNA的相对表达量随着斑块成熟度的升高而逐渐降低，二者呈负相关关系（r＝－0．70，P＜0．01），见图1。

表2　T2DM合并CAS各组间NLRP3－mRNA相对表达量检测结果比较

表2　T2DM合并CAS各组间NLRP3－mRNA相对表达量检测结果比较

注：＊与T2DM轻度斑块组比较，P＜0．05

组别　例数　N L R P 3 －m R N A相对表达量T 2 D M轻度斑块组　32　5．03±1．14 T 2 D M中度斑块组　38　2．74±1．19＊T 2 D M重度斑块组　11　2．28±0．62＊F值　－　4 5 ．5 3 P值　－　P ＜0 ．0 1

图1　T2DM合并CAS组NLRP3－mRNA相对表达量趋势图

3　讨论

T2DM是最常见的内分泌代谢综合征，在疾病的发生和发展中伴有自发的炎性反应，且易引发多种并发症，其中心血管疾病是最重度的并发症之一，也是导致T2DM患者死亡的重要因素［6，7］。NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物，参与T2DM及其并发症的发生和发展［8］。NLRP3可被多种物质刺激活化，如胆固醇晶体、神经酰胺、活性氧、胰岛淀粉样多肽等。NLRP3活化后与凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis－associatedspeck－likeproteincontaininga CARD，ASC）结合，并促使ASC和前半胱天冬酶1 （pro－caspase－1）结合，形成NLRP3炎性小体［9］。炎性小体活化后，ASC刺激pro－caspase－1使其裂解为有活性的caspase－1。有活性的caspase－1使前白介素pro－IL－1β裂解成为成熟的炎性因子IL－1β并产生炎性反应，促使T2DM发生CAS病变［10］。

本文研究结果显示，NLRP3－mRNA在各病例组中均高表达，且相对表达量均显著高于正常对照组（P均＜0．05），这与Hermansson等［11］的报道一致。而且T2DM合并CAS组中NLRP3－mRNA的相对表达量显著高于单纯T2DM组和单纯CAS组 （P均＜0．05），提示T2DM并发CAS与NLRP3－mRNA高表达相关。具体作用机制可能是T2DM患者机体中PBMCs受到胰岛淀粉样多肽或者胆固醇晶体等的刺激，使细胞内NLRP3－mRNA活化，招募ASC及pro－caspase－1形成活化的NLRP3炎性小体，并促使炎性因子成熟和释放，产生炎症反应。继而在炎症的持续作用下使胰岛β细胞和颈动脉发生病变，导致T2DM和CAS的发生发展。本文研究结果还发现，虽然单纯T2DM组中NLRP3－mRNA相对表达量高于单纯CAS组，但这两组的NLRP3－mRNA相对表达量差异无统计学意义（P＞0．05），引起这一结果的原因仍不清楚，有待进一步研究。

本文研究通过对T2DM合并不同程度CAS患者NLRP3－mRNA相对表达量的检测结果发现，在斑块形成的不同时期，NLRP3－mRNA的相对表达量不同，其中T2DM轻度斑块组表达量显著高于中度和重度斑块组，差异均有统计学意义（P均＜0．05）。且NLRP3－mRNA的相对表达量与CAS斑块的成熟程度呈负相关（r＝－0．70，P＜0．01）。即在CAS斑块形成初期NLRP3－mRNA的相对表达量最高，随着CAS斑块的逐渐成熟，NLRP3－mRNA的表达水平逐渐降低，提示NLRP3－mRNA高表达，即炎症增强极有可能是启动T2DM患者CAS斑块形成的重要因素；而炎症缓解或斑块成熟又可使NLRP3－mRNA表达下调，但其中的具体机制尚不十分明确，有待进一步研究。

综上所述，NLRP3－mRNA高表达与T2DM并发CAS的发生、发展密切相关，检测NLRP3－mRNA表达量可能会成为诊断、预防和治疗T2DM并发CAS的新靶点。但连续检测NLRP3－mRNA表达量评估T2DM合并CAS病情的具体方法，仍有待进一步的研究。

1Fullerton MD，Steinberg GR，Schertzer JD．Immunometabolism of AMPK in insulin resistance and atherosclerosis．Mol Cell Endocrinol，2013，366：224－234．

2Lee HM，Kim JJ，Kim HJ，et al．Upregulated NLRP3 inflammasome activation in patients with type 2 diabetes．Diabetes，2013，62：194－204．

3中华医学会糖尿病学分会．中国2型糖尿病防治指南 （2013年版）．中华糖尿病杂志，2014，30：5－8．

4Rovite V，Maurins U，Megnis K，et al．Association of F11 polymorphism rs2289252 with deep vein thrombosis and related phenotypes in population of Latvia．Thromb Res，2014，134：659－663．

5Luo B，Wang F，Li B，et al．Association of nucleotide－binding oligomerization domain－like receptor 3 inflammasome and adverse clinical outcomes in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy．ClinChemLabMed，2013，51：1521－1528．

6Lamkanfi M，Kanneganti TD．Nlrp3：an immune sensor of cellular stress and infection．Int J Biochem Cell Biol，2010，42：792－795．

7Schroder K，Zhou R，Tschopp J．The NLRP3 inflammasome：a sensor for metabolic danger？Science，2010，327：296－300．

8Dinarello CA．Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases．Blood，2011，117：3720-3732．

9Bujak M，Frangogiannis NG．The role of IL－1 in the pathogenesis of heart disease．Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2009，57：165－176．

10De Nardo D，Latz E．NLRP3 inflammasomes link inflammation and metabolic disease．Trends Immunol，2011，32：373－379．

11Hermansson C，Lundqvist A，Wasslavik C，et al．Reduced expression of NLRP3 and MEFV in human ischemic heart tissue．Biochem Biophys Res Commun，2013，430：425－428．

（本文编辑：杨军）

The correlation research between the expression of NLRP3-mRNA in patients with type 2 diabetes mellitus and carotid artery atherosclerosis

XIE Hai-long1，LI Jun-li2，WAN Jing2，et al.
1Medical College，the Graduate School of Changjiang University，Jingzhou 434020，China2Department of Clinical Laboratory，the Center Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434020，China

ObjectiveTo study the correlation between the expression of NLR family，pyrin domain containing 3（NLRP3）mRNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of patients with type 2 diabetes mellitus（T2DM）and carotid artery atherosclerosis（CAS）.Methods107 cases patients with T2DM，35 cases patients with CAS and 35 cases healthy controls from June 2013 to December 2013 in our hospital were collected.The T2DM patients were divided into T2DM group（26 cases），T2DM combine mild plaque group（32 cases），T2DM combine midrange plaque group（38 cases），and T2DM combine severe plaque group（11 cases）.The expression levels of NLRP3-mRNA in PBMCs in all the groups were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，and the results were analyzed statistically.ResultsThere was statistical significance in the difference of NLRP3-mRNA expression level among control group，T2DM group，T2DM combine CAS group and CAS group（P＜0.01）.The NLRP3-mRNA expression levels in T2DM group，T2DM combine CAS group and CAS group were all higher than that of control group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.The NLRP3-mRNA expression level in T2DM combine CAS group was higher than that of T2DM group and CAS group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.There was statistical significance in the difference of NLRP3-mRNA expression level among all the T2DM combine CAS groups（P＜0.01）.The NLRP3-mRNA expression levels in T2DM combine severe plaquegroup and T2DM combine midrange plaque group were all lower than that of T2DM combine mild plaque，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.The correlation research results showed that the NLRP3-mRNA expression level was negative correlated with plaque maturation degree（r=-0.70，P＜0.01）. ConclusionThe NLRP3-mRNA is correlated with the occurrence and development of T2DM combine CAS.

NLRP3；Peripheral blood mononuclear cells；Carotid artery atherosclerosis；Type 2 diabetes mellitus；Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

荆州市科技局资助项目（2012041）

李承彬，E-mail：jzlcb001@163.com

（2014－12－23）