兔颈动脉球囊损伤后动脉内膜、中膜厚度及面积的时相性变化

崔丽，张恩园，李广平，杨万松，焦占全

(天津医科大学第二医院，天津 300211)

冠状动脉再狭窄(RS)影响冠心病介入治疗患者的长期预后，药物洗脱支架使再狭窄率明显降低，但仍维持在5%～12%［1，2］。动脉血管的弹性回缩、血栓形成、血管壁负性重塑及血管壁中层平滑肌细胞的增殖均参与经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)术后再狭窄这一复杂的病理生理过程［3，4］。2012年12月～2014年12月，我们通过制作兔颈动脉球囊损伤模型，观察球囊损伤后动脉内膜、中膜厚度及面积的时相性变化，探讨平滑肌细胞(VSMC)增殖在再狭窄中的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康长耳白兔60只，雌雄不限，体质量(2.0±0.2)kg，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，标准兔料，自由摄食水，适应性饲养1周。

1.2 颈动脉球囊损伤模型的建立及分组 将60只白兔随机分为对照组(10只)及球囊损伤组(50只)，对照组正常饲养28 d处死。球囊损伤组先对白兔进行称质量，术前15 min予肝素钠盐水(500 U/kg)、3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)经耳缘静脉注射，待兔出现肌力下降、软瘫等麻醉反应后，固定于实验动物台，常规备皮、消毒，颈部正中切口，逐层切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉远心端，血管夹夹闭颈总动脉、颈内动脉，选用冠脉2.5 mm×15 mm球囊，自颈外动脉近心端插入球囊导管至主动脉弓处，连接手推式压力泵，回拉至颈总动脉分叉处，迅速撤压，回送至主动脉弓处，压力为8～16 ATM共5次，导管撤出，结扎颈外动脉，恢复颈总动脉、颈内动脉血流;对侧只分离颈动脉，不予球囊损伤，逐层缝合伤口，庆大霉素4万U喷洒伤口，4万U肌注。球囊损伤术后1 h耳缘静脉注射2 mL的0.5 mg/mL的伊文氏蓝，注射后2 h处死2只，自主动脉跟部取下双侧颈总动脉血管标本，球囊损伤侧血管较正常侧血管扩张且着色明显，明显蓝染，对侧只有轻度着色。余48只白兔正常饲养至术后3、7、14、28 d，于以上时点各处死 12 只并取材。损伤侧动脉段为模型组(Model组)，损伤对侧颈动脉段作为假手术组(Sham组)。

1.3 动脉内膜、中膜形态学观察及厚度、面积测算按照实验分组设计时间，3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉，颈部正中切口，沿颈总动脉向下分离至主动脉弓，向上分离至颈外动脉结扎处，生理盐水反复冲洗，取约1.0 cm动脉段，置于新鲜配制的4%多聚甲醛、2%戊二醛磷酸缓冲液(pH 7.4)固定。石蜡包埋，间断均匀切片，切片厚5 μm，HE染色，光镜下观察移行平滑肌细胞增殖和内膜增厚情况。按组织学划分，内弹力膜以内为血管内膜，内、外弹力膜之间为中膜。5倍物镜下将完整的血管横切面HE染色图像摄入计算机图像分析系统，应用图像处理软件随机选取10个点分析，测量内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)，并计算血管内膜、中膜厚度比(IT/MT);选取3个切面测量相应内膜面积(IA)、中膜面积(MA)，计算内膜与中膜面积比(IA/MA)。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量数据以表示，多组间比较进行单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉内膜、中膜形态学变化 对照组及Sham组动脉内膜光滑完整，管腔通畅，内膜、中膜和外膜分界清楚。内膜和中膜以波浪状完整连续的内弹力板为界，中膜层为4～6层平滑肌细胞同心圆排列，周围可见弹力纤维组织。Model组术后3 d，内皮细胞脱落，暴露内皮下的网状结构，内膜表面炎性细胞浸润，中层弹力纤维增多。Model组术后7 d，部分内弹力板断裂，内膜轻度增厚，中层平滑肌细胞数目增多，弹力纤维增多，中膜厚度增加。Model组术后14 d，新生内膜厚度明显增加，细胞外基质(胶原和弹力纤维)增加，中膜厚度有所下降，管腔相对缩窄。Model组术后28 d，内膜明显不规则增生，增生的细胞呈梭形，少量泡沫细胞浸润，平滑肌细胞排列紊乱，细胞外基质大量分泌。见图1。

图1 各组颈动脉HE染色(×200)

2.2 动脉IT、MT、IA、MA变化 结果见表1。

表1 各组颈总动脉IT、MT、IA、MA比较()

表1 各组颈总动脉IT、MT、IA、MA比较()

注:与对照组相比，*P ＜0.05;与 Sham 组相比，ΔP ＜0.05;与 Model组损伤后3 d相比，○P ＜0.05;与 Model组损伤后7 d相比，□P ＜0.05;与 Model组损伤后14 d相比，☆P ＜0.05。

组别 n IT(μm) MT(μm) IT/MT IA(μm2) MA(μm2)IA/MA Sham 组损伤后3 d 12 2.37±0.12 52.6±1.9 0.045±0.003 6403.6± 559.5 148514± 8339 0.04±0.005损伤后7 d 12 2.35±0.09 52.3±1.8 0.045±0.002 6422.7± 552.4 151902± 8429 0.04±0.005损伤后14 d 12 2.41±0.12 52.5±1.1 0.046±0.003 6362.9± 347.7 150215±13850 0.04±0.005损伤后28 d 12 2.46±0.25 52.1±1.5 0.047±0.004 6209.3± 178.0 152270±16637 0.04±0.004 Model组损伤后3 d 12 2.33±0.30 61.1±12.2 0.039±0.006 6862.2± 1029.5 270968±75741* Δ 0.03±0.012损伤后7 d 12 8.72± 2.79 93.4±22.1* Δ○ 0.090±0.030 8577.1± 1311.1 349631±59138* Δ○ 0.03±0.004损伤后14 d 12 42.26±12.36* Δ○□ 80.8±13.5*Δ○□ 0.511±0.130* Δ○□ 105879.4±35546.1* Δ○□ 390756±112567* Δ○ 0.27±0.058* Δ○□损伤后28 d 12 132.15±35.88* Δ○□☆ 84.3±7.6* Δ○□ 1.580±0.447* Δ○□☆ 354490.6±164047.6* Δ○□☆ 521067±157346*Δ○□☆ 0.66±0.136* Δ○□☆对照组 10 2.39±0.14 52.4±1.6 0.046±0.003 6756.9± 977.9 151434±16652 0.05±0.009

3 讨论

颈动脉球囊损伤模型是动脉粥样硬化及再狭窄研究常用的动物模型［5］，本实验中采用经颈外动脉入路直接球囊扩张拖拉兔颈动脉造成内皮剥脱模拟PTCA后内皮损伤，复制再狭窄形成过程，颈部动脉易于分离、肉眼直视下操作，手术操作简单，模型动物存活率高、重复性好，颈总动脉较长，获得实验组织较多，利于进一步的分子生物学及病理学实验。此外通过注射伊文氏蓝观察损伤后血管出现明显蓝染，表明内皮损伤成功，其主要机制为伊文氏蓝能与血浆中蛋白完全结合，在内皮屏障遭到破坏时进入内皮下出现蓝染从而反映内皮损伤的程度［6］。

RS形成是一个复杂的病理生理过程，内膜增生、弹性回缩、血栓、炎症均参与其中［7，8］。本研究动态观察损伤后颈动脉的IT及IA时相性变化，发现损伤3 d时内膜表面炎性细胞浸润，中膜弹力纤维增多，少量平滑肌细胞增殖，MA较对照组扩大，7 d时中膜平滑肌细胞数目及弹力纤维增多，MT、MA增加明显，IT较对照组有增加趋势，14 d时IT、IA明显增加，而MT有所下降，28 d时IT、IA继续增厚达高峰，MT较14 d时无明显差异，IT/MT及IA/MA在损伤后14 d明显增大，28 d时达高峰，表明急性损伤后3～7 d中膜血管平滑肌细胞开始明显增殖，术后7～14 d为中膜血管平滑肌细胞向内膜下迁移和再增殖过程，术后14～28 d内膜增生的血管平滑肌细胞合成大量的细胞外基质，导致管腔的狭窄和血管负性重塑，最终导致RS形成。上述结果与国内外文献［8～10］报道的再狭窄模型病理改变基本一致，模拟了临床冠状动脉成形术后的病理变化，表明经颈外动脉入路可成功建立颈总动脉损伤模型，可用于再狭窄的病理、机制及药物干预研究。同时内膜时相性变化提示血管平滑肌细胞的增殖、向内膜迁移及细胞外基质分泌，血管负性重构均在再狭窄形成中发挥重要作用，但更深入的分子机制尚需进一步研究。

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