精子DNA完整性和 hOGG1 rs1052133与原发性男性不育的相关性研究*

马 强申 琴焦海燕

1. 宁夏医科大学医学遗传学与细胞生物学系（银川 750004）；

2. 川北医学院附属医院检验科； 3. 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室

精子DNA完整性和 hOGG1 rs1052133与原发性男性不育的相关性研究*

马 强1，2△申 琴1，3△焦海燕1，3**

1. 宁夏医科大学医学遗传学与细胞生物学系（银川 750004）；

2. 川北医学院附属医院检验科； 3. 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室

目的 探讨人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase，hOGG1）基因rs1052133（Cys326Ser）及精子DNA完整性对原发性男性不育的影响。方法 收集2011年8月至2012年12月间在宁夏医科大学总医院就诊的332例原发性男性不育患者和329例健康体检者分别作为病例组和对照组，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测两组人群hOGG1 rs1052133基因型；采用精子染色质扩散实验（SCD）检测病例组和对照组精子DNA损伤程度。分析精子DNA完整性与精液参数的相关性以及hOGG1 rs1052133不同基因型与原发性男性不育的相关性以及对精子DNA完整性的影响。结果 原发性男性不育患者精子DNA碎片指数（DFI）高于对照组；原发性男性不育患者精子DFI与前向运动精子和非前向运动精子呈负相关（r =-0.35和-0.13，P＜0.05），与不动精子呈正相关（r =0.24，P＜0.05）；携带hOGG1 rs1052133CC基因型的个体患原发性少弱精子症的风险是携带GG型个体的1.93倍。rs1052133与吸烟和饮酒与原发性男性不育的发病风险无交互作用，同时该位点三种不同基因型的患者间精子DFI差异无统计学意义。结论 原发性男性不育患者精子DNA完整性降低，并且精子DNA损伤可导致精液质量下降，是原发性男性不育的病因之一。 hOGG1 rs1052133CC基因型可能是原发性男性不育的危险因素，但该位点可能不影响精子DNA完整性。

人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶； 多态性， 单核苷酸； 不育， 男性

精子发生是一个连续的、多步骤的过程，并且持续存在于内源性和外源性活性氧（ROS）如超氧化物阴离子和过氧化氢物质中。氧化应激可导致精子细胞膜和精子核DNA和线粒体DNA断裂［1］，通过影响精子质量继而降低男性生育力。然而，精子细胞内缺乏一系列的DNA损伤修复系统，根据不同的DNA损伤类型，机体启动相应的修复途径完成受损精子DNA的修复，其中碱基切除修复是主要的修复途径之一。

人类8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1（hOGG1）是碱基切除修复途径中的关键酶，它具有糖苷酶和脱嘌呤或脱嘧啶裂解酶双重活性，能特异地切除DNA氧化性损伤的特异性产物8-羟基鸟嘌呤［2］。hOGG1基因表达具有组织特异性，在人类睾丸和胚胎组织中表达最高，对于防止精子基因突变和胚胎免受氧化损伤是必不可少的［3］。人类hOGG1基因中存在较多的多态性位点，其中rs1052133（G/C，Cys/Ser）是目前研究较多的一个，但其主要集中在与肿瘤的遗传易感性方面［4-7］，鲜见其与原发性男性不育的研究。因此，本研究主要探讨精子DNA损伤及hOGG1基因 rs1052133对原发性男性不育的影响，为原发性男性不育的病因学研究及预防提供依据。

材料与方法

一、研究对象纳入

按照知情同意原则，收集2011年8月至2012年12月间在宁夏医科大学总医院就诊的332例原发性男性不育患者和329例健康体检者（均有自然生育史），其中原发性不育患者包括非梗阻性无精子症87例、少弱精子症166例和精液正常的男性不育79例。采集所有研究对象2mL静脉血，收集上述不育患者和30例正常生育男性（对照组）精液一份，并调查其吸烟、饮酒状况。

二、精液常规分析

按照《WHO人类精液检验与处理实验室手册（第五版）》的要求，采用全自动精子分析系统检测原发性男性不育患者和对照组精子浓度、精子活力等精液常规参数。

三、精子DNA损伤程度检测

运用精子染色质扩散实验［8］检测少弱精子症和精液正常不育患者的精子DNA损伤程度。计数300个以上精子细胞，观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4个等级。小光晕以精子头直径≤1/3为判断标准；中光晕精子头直径＞1/3，而≤2/3；大光晕精子头直径＞2/3。大和中光晕表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。精子DNA损伤程度用精子DNA碎片指数（DFI）表示，DFI=（小光晕精子数+无光晕精子数）/总数×100%。

四、hOGG1 rs1052133基因型分析

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测不育患者和健康体检者hOGG1基因 rs1052133位点基因型。

（一）血液基因组DNA提取

用天根生化科技有限公司生产的血液基因组提取试剂盒，严格按照说明书步骤提取研究对象的血液基因组DNA，储存在-20℃备用。

（二）PCR扩增

［9］报道的引物序列（Forward Primer：5´-TTGCCTTCGGCCCTGTTCCCCAAGGA-3´，Reverse Primer：5´-TTGCTGGTGGCTCCTGAGCA TGGCCG-3´）扩增包含rs1052133位点在内的一段DNA序列。扩增体系（12.5μL）：2×Master Mix 6.25μL，Taq DNA polymerase（5U/μL）0.125μL，Forward Primer（10μmol/L）0.25μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.25μL，DNA Template 1μL，ddH2O 4.625μL。扩增条件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，34 Cycles ；72℃ 10min。扩增产物储存于4℃备用。

（三）RFLP 技术检测原发性男性不育组和对照组hOGG1 rs1052133基因型

采用NEB公司生产的MspⅠ限制性内切酶，严格按照说明书步骤对上述PCR产物进行酶切。酶切完成后，将酶切产物进行电泳，并在Syngene 凝胶成像仪下观察并记录结果，判断基因型。

五、统计学分析

结 果

一、精液常规参数

如表1所示，少弱精子症组患者精子浓度和前向运动精子百分数均低于精液正常不育组和对照组，而非前向运动精子和不动精子百分数高于精液正常不育组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而精液正常不育组和对照组相比，精子浓度、前向运动精子、非前向运动精子和不动精子百分数均无显著性差异（P＞0.05）。

二、精子DNA损伤程度

少弱精子症组、精液正常不育组和对照组中，精子DFI分别为（50.0±22.1）%、（38.2±20.7）%和（21.4±9.2）%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

三、原发性男性不育患者精子DFI与精子活力的相关性

相关性分析显示，原发性男性不育患者精子DFI与前向运动精子百分率和非前向运动精子百分率呈负相关（r =-0.35和-0.13，P＜0.05），与不动精子百分率呈正相关（r =0.24，P＜0.05），见图2。

表1 少弱精子症组和精液正常不育组精液常规参数

图1 原发性男性不育组和对照组精子DFI比较（%）（P＜0.05）

图2 原发性男性不育患者精子DFI与前向运动精子、非前向运动精子和不动精子的相关性A: 原发性男性不育患者精子DFI与前向运动精子的相关性； B: 原发性男性不育患者精子DFI与非前向运动精子的相关性； C: 原发性男性不育患者精子DFI与不动精子的相关性

四、hOGG1 rs1052133与原发性男性不育的相关性研究

（一）hOGG1 rs1052133位点PCR扩增及PCRRFLP进行基因型分析

参考文献合成PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成），其中上游引物为5´-TTGCCTTCGGC CCTGTTCCCCAAGGA-3´，下游引物为5´-TTGCT GGTGGCTCCTGAGCATGGCcG-3´，PCR反应体系（12.5μL）为：2× Master Mix 6.25μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.125μL，上游引物（10μmol/L）0.25μL，下游引物（10μmol/L）0.25μL，ddH2O 4.625μL，DNA模板（50ng/μL）1μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min。PCR扩增产物中，若rs1052133位点为C时，则能被MspⅠ酶识别并切开；若rs1052133位点为G时，则不能被MspⅠ酶识别。因而，rs1052133 PCR扩增产物酶切孵育后可产生168bp、142bp、26bp三个片段，根据电泳结果判断基因型（图3）：CC型142bp、26bp，CG型168bp、142bp、26bp，GG型168bp。由于26bp片段太小，电泳时已经泳出琼脂糖凝胶，无法观察到。每种基因型的个体各挑选2例，PCR扩增，将扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序验证，结果显示，酶切分型和测序完全一致，提示酶切分型结果可靠。

图3 rs1052133经BslⅠ酶切后电泳图M泳道: DNA maker； 1， 2泳道: GG基因型； 3， 6泳道: CC基因型； 4，5泳道: CG基因型

（二）hOGG1 rs1052133与原发性男性不育的相关性

原发性男性不育组和对照组中hOGG1 rs1052133三种基因型频率分布具有显著性差异（P＜0.05），携带CC基因型的个体患原发性男性不育的风险是携带GG型的个体的1.81倍（OR=1.81，95%CI：1.10-3.00）；而G、C等位基因频率在两组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步的分层分析发现，hOGG1 rs1052133与无精子症和精液正常的男性不育无相关性，与原发性少弱精子症显著相关，携带CC基因型的个体患原发性少弱精子症的风险是GG型个体的1.93倍（表2）。

五、hOGG1 rs1052133不同基因型间精子DFI比较

分析显示，携带rs1052133 GG、CG、CC三种不同基因型个体间精子DFI分别为（48.1±22.4）%、（43.3±21.8）%和（48.8±23.1）%，差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

六、hOGG1 rs1052133与吸烟饮酒的交互作用对原发性男性不育的影响

通过单纯病例研究发现，hOGG1 rs1052133与吸烟和饮酒对原发性男性不育的发病风险无交互作用（P＞0.05）。

表2 hOGG1 rs1052133与原发性少弱精子症的相关性

图4 携带rs1052133三种不同基因型的个体精子DFI比较

讨 论

精子是遗传物质的携带者，其质量对受精能力和胚胎质量均有较大的影响［10，11］。临床上常用的评价精子质量的指标有精子浓度、精子活力、精子活率和精子形态等，但这些指标不能完全反映精子质量。在体内，精子会受到睾丸内外因素的影响而造成DNA断裂，如果受损精子DNA得不到及时有效地修复，则可导致男性生育力下降，甚至不育。本研究结果表明，原发性男性不育患者精子DNA损伤程度高于生育男性，并且其精子DFI与前向运动精子百分率和非前向运动精子百分率呈负相关，与不动精子百分率呈正相关，提示不育患者精子DNA完整性降低，并且随着精子DFI增高，精子活力呈下降趋势，与文献报道的一致［12，13］，因此，精子SCD实验可作为评价精子质量的新指标。

精子DNA在受到体内外有害物质的损伤后，机体会启动DNA损伤动修复系统，其中最重要的是碱基切除修复和核苷酸切除修复。人类基因的单核苷酸多态性（SNP）是第三代遗传标记，同时它也是不同个体基因功能差异的重要遗传学基础。人类DNA损伤修复基因的SNP可能会影响其蛋白功能，导致不同个体修复能力不同，使其修复受损DNA的能力下降，导致基因组完整性降低而影响细胞功能。男性精子DNA损伤可表现为精子质量下降，受精能力降低，甚至不育。hOGG1基因rs1052133可以导致Ser/Cys氨基酸改变，影响hOGG1酶的活性，降低其DNA修复能力。rs1052133是肿瘤遗传易感性研究的热点，单个研究和Meta 分析均显示其与多种肿瘤相关［14-18］，然而rs1052133与男性不育的研究较少见。Ji等［19］的研究表明，在显性遗传模型下，rs1052133CG+GG基因型的个体患原发性男性不育的风险增加。而本研究显示，携带rs1052133CC基因型的个体患原发性男性不育的风险是GG基因型的1.81倍（OR=1.81，95%CI=1.10-3.00）。本研究结果与Ji等的结果相反，可能主要由于研究对象的纳入差异。Ji等的病例组纳入了620例原发性男性不育患者，未纳入无精子症患者，而本研究的病例组中包含了87例无精子症患者。此外，本研究与hOGG1 rs1052133位点的功能学研究也有所不同。研究发现［20］，OGG1-Ser326（CC）转导细胞比OGG1- Cys326（GG）转导细胞能更高效地抑制8-oxo-Gua 诱导的突变，因此人细胞OGG1-Cys326 修复8-oxo-Gua 所致突变的能力弱于OGG1-Ser326，而本研究显示在群体水平hOGG1 rs1052133CC基因型是原发性男性不育的危险因素。

本研究也表明，虽然hOGG1 rs1052133 CC基因型是原发性男性不育的危险性因素，但是与CG、CC两种基因型相比，CC基因型患者的精子DFI并无差异，提示hOGG1 rs1052133对精子DNA损伤程度无影响。同时，hOGG1 rs1052133位点与吸烟和饮酒对原发性男性不育无交互作用。DNA损伤修复是一个复杂的通路，其中涉及到多条信号通路和多个关键基因的共同作用，本研究所选择的位点可能起微效作用，其他基因的共同作用可能参与了精子DNA损伤的修复。因此，其他DNA损伤修复相关基因的SNP位点与精子DNA损伤的关系还有待于进一步的研究。

参 考 文 献

1 Aitken RJ， Baker MA. Oxidative stress， sperm survival and fertility control. Mol Cell Endocrinol 2006； 250（1-2）: 66-69

2 Arai K， Morishita K， Shinmura K， et al. Cloning of a human homolog of the yeast OGG1 gene that is involved in the repair of oxidative DNA damage. Oncogene 1997；14（23）: 2857-2861

3 Karahalil B， Hogue BA， de Souza-Pinto NC， et al. Base excision repair capacity in mitochondria and nuclei: tissue-specific variations. FASEB J 2002； 16（14）: 1895-1902

4 Hashimoto T， Uchida K， Okayama N， et al. Interaction of OGG1 Ser326Cys polymorphism with cigarette smoking in head and neck squamous cell carcinoma. Mol Carcinog 2006； 45（5）: 344-348

5 Hasui Y， Hamanaka Y， Okayama N， et al. Association of the OGG1 Ser326Cys polymorphism with tooth loss. J Clin Lab Anal 2006； 20（2）: 47-51

6 Kohno T， Kunitoh H， Toyama K， et al. Association of the OGG1-Ser326Cys polymorphism with lung adenocarcinoma risk. Cancer Sci 2006； 97（8）: 724-728

7 Sorensen M， Raaschou-Nielsen O， Hansen RD， et al. Interactions between the OGG1 Ser326Cys polymorphism and intake of fruit and vegetables in relation to lung cancer. Free Radic Res 2006； 40（8）: 885-891

8 谷龙杰. 精子染色质结构检测在男性不育诊断和治疗中的应用研究. 北京: 中国协和医科大学 2009: 1-82

9 Wu F， Zhang Z， Wan J， et al. Genetic polymorphisms in hMTH1， hOGG1 and hMYH and risk of chronic benzene poisoning in a Chinese occupational population. Toxicol Appl Pharmacol 2008； 233（3）: 447- 453

10 Li Y， Kalo D， Zeron Y， et al. Progressive motility-a potential predictive parameter for semen fertilization capacity in bovines. Zygote （Cambridge， England） 2014: 1-13

11 Tandara M， Bajic A， Tandara L， et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology 2014； 2（5）: 678-686

12 Irvine DS， Twigg JP， Gordon EL， et al. DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality. J Androl 2000； 21（1）: 33-44

13 Zhang Y， Wang H， Wang L， et al. The clinical signifi cance of sperm DNA damage detection combined with routine semen testing in assisted reproduction. Mol Med Rep 2008； 1（5）: 617-624

14 Zhou PT， Li B， Ji J， et al. A systematic review and meta-analysis of the association between OGG1 Ser326Cys polymorphism and cancers. Med Oncol 2015；32（2）: 472

15 Wang Z， Gan L， Nie W， et al. The OGG1 Ser326Cys polymorphism and the risk of esophageal cancer: a metaanalysis. Genet Test Mol Bioma 2013； 17（10）: 780-785

16 Guo CL， Han FF， Wang HY， et al. Meta-analysis of the association between hOGG1 Ser326Cys polymorphism and risk of colorectal cancer based on case-control studies. J Cancer Res Clin Oncol 2012； 138（9）: 1443-1448

17 Li Z， Guan W， Li MX， et al. Genetic polymorphism of DNA base-excision repair genes （APE1， OGG1 and XRCC1） and their correlation with risk of lung cancer in a Chinese population. Arch Med Res 2011； 42（3）: 226-234 18 Kumar A， Pant MC， Singh HS， et al. Role of OGG1 Ser326Cys polymorphism and 8-oxoguanine DNA damage in risk assessment of squamous cell carcinoma of head and neck in North Indian population. Mutat Res 2011； 726（2）: 227-233

19 Ji G， Yan L， Liu W， et al. OGG1 Ser326Cys polymorphism interacts with cigarette smoking to increase oxidative DNA damage in human sperm and the risk of male infertility. Toxicol Lett 2013； 218（2）: 144-149

20 Yamane A， Kohno T， Ito K， et al. Differential ability of polymorphic OGG1 proteins to suppress mutagenesis induced by 8-hydroxyguanine in human cell in vivo. Carcinogenesis 2004； 25（9）: 1689-1694

（2015-07-28收稿）

Correlation analysis of sperm DNA integrity/hOGG1 rs1052133 and primary male infertility*

Ma Qiang1，2△， Shen Qin1，3△， Jiao Haiyan1，3**
1. Department of Medical Genetics and Cell Biology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；
2.Department of Clinical Laboratory， Affi liated Hospital of North Sichuan Medical College；
3. Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education， Ningxia Medical University

Jiao Haiyan， E-mail: hyjiao1602@hotmail.com

Objective To study the effect of human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase （hOGG1）SNP rs1052133 and sperm DNA integrity on primary male infertility. Methods Based on case-control and case-only study design， polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms （PCR-RFLP） was used to measure the genotypes of rs1052133 among 332 primary male infertility patients and 329 controls. Sperm chromatin depression （SCD）test was used for the examination of sperm DNA integrity. The correlation between sperm DFI and sperm parameters as well as the effect of different rs1052133 genotypes to the genetic susceptibility of male infertility and DFI were analyzed. Results The DFI of primary male infertility was higher than that of fertile man， and DFI negatively correlated with the ratioof forward motile sperm and the ration of non-forward motile sperm（r = -0.35 and -0.13， P＜0.05）， but positively correlated with immotile sperm （ r =0.24， P＜0.05） . The risk of rs1052133 CC genotype carriers were 1.93 fold higher than that of rs1052133 GG genotype. What’s more， there were no interaction effect between male infertility and cigarette smoking and alcohol consumption as well as no signifi cant difference in sperm DFI among these three genotypes. Conclusion The sperm DNA integrity in male infertility patients were lower than that of fertile men. Sperm DNA damage which signifi cant negative correlated with sperm quality was a cause of primary male infertility. Although the CC genotype of hOGG1 rs1052133 was associated with an increased risk of male infertility， it may be not associated with sperm DNA integrity.

human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase； polymorphism， Single nucleotide；infertility， male

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.004

R 698.2

△共同第一作者

资助: 宁夏自然科学基金项目（ NZ14070）

**通讯作者， E-mail: hyjiao1602@hotmail.com