HHcy大鼠tHcy与阴茎海绵体内NOS和H2S的相关性研究*

桂士良腾 飞曹会峰迟宝进

罗振国2郭玉刚2杜丛林2崔大伟2吴长利1**

1. 天津医科大学第二医院泌尿科（天津 300211）；

2. 佳木斯大学附属第一医院； 3. 吉林医药学院附属医院

HHcy大鼠tHcy与阴茎海绵体内NOS和H2S的相关性研究*

桂士良1，2△腾 飞3△曹会峰2迟宝进2

罗振国2郭玉刚2杜丛林2崔大伟2吴长利1**

1. 天津医科大学第二医院泌尿科（天津 300211）；

2. 佳木斯大学附属第一医院； 3. 吉林医药学院附属医院

目的 探讨甜菜碱（Betaine， Bet）对高同型半胱氨酸血症（HHcy）大鼠血浆总同型半胱氨酸（tHcy）及阴茎海绵体内一氧化氮合酶（NOS）、硫化氢（H2S）及勃起功能的影响。方法 选用Wistar雄性大鼠45只，随机选出10只为对照组（A）。其余用3%蛋氨酸喂养，造模成功后的30只，随机分为：高同型半胱氨酸组（B）、盐酸甜菜碱治疗组（C）、叶酸、维生素B12治疗组（D）。A组给予正常饲料；B组3%蛋氨酸喂养。C组、D组，在喂养3%蛋氨酸的同时，分别给予Bet和叶酸、维生素B12灌胃。4周后，进行APO实验、大鼠阴茎海绵体内压（ICP）的测定、检测tHcy浓度及阴茎海绵体内NOS活性及H2S浓度。结果 与A组比较，B组tHcy升高、阴茎海绵体内NOS活性及H2S浓度降低，ICP压力减低，勃起次数减少，有差异性，具统计学意义（P＜0.05）。C、D组与B组比较，tHcy降低、阴茎海绵体内NOS活性及H2S浓度增高，ICP压力增高，勃起次数增多（P＜0.05），同型半胱氨酸（Hcy）与NOS（rA=-0.857、rB=-0.976 、rC=- 0.903、rD=-0.847）和H2S（rA=-0.857、rB=-0.976、rC=- 0.903、rD=-0.847）均成负性相关。C组与D组比较，tHcy降低、阴茎海绵体内NOS活性及H2S浓度升高，ICP压力增高，勃起次数增加，差异具统计学意义（P＜0.05）。结论 tHcy升高影响阴茎海绵体内NOS活性及H2S浓度的降低是引发勃起功能障碍（Erectile dysfunction ，ED）的机制之一。Bet是治疗HHcy所致ED的有效药物之一。

甜菜碱； 高同型半胱氨酸血症； 硫化氢； 一氧化氮合酶； 勃起功能障碍

高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocystinemia，HHcy）是指空腹状态下血浆总的同型半胱氨酸（tHcy）浓度大于15μmol/L。为心、脑血管疾病及外周血管类疾病的危险因素之一［1］。男性tHcy浓度大于女性，且患HHcy的概率明显较女性高。陈庆军等［2］研究HHcy大鼠时，发现HHcy与勃起功能障碍（ED）有关，并提出HHcy是ED的独立危险因素。所以，我们观察HHcy状态下大鼠阴茎海绵体内一氧化氮合酶（NOS）活性及硫化氢（H2S）的变化以及其对勃起功能的影响，并给与甜菜碱（Betaine， Bet）进行干预治疗。本文意在对HHcy进行Bet干预治疗，以观察tHcy和大鼠阴茎海绵体内NOS活性及H2S的变化以及其对勃起功能的影响。

材料与方法

一、实验动物及模型建立

HHcy大鼠动物模型的建立：用Wistar雄性大鼠纯系2月龄雄性45只（佳木斯大学动物实验中心提供），体质量280g～310g。适应性喂养1周后，随机取10只为对照组（A组）给予正常饲料喂养。 余35只给予3%蛋氨酸饲料4周后，取血检tHcy浓度，tHcy浓度＞（24.15±0.96）μmol/L，即为造模成功。将造模成功的大鼠随机分成3组：（1）HHcy大鼠模型组（B组） 继续给予3%蛋氨酸饲料喂养；（2）HHcy大鼠Bet治疗组（C组） 继续给予3%蛋氨酸饲料喂养，每天定时按照60 mg/（kg•d）的剂量给与Bet，0.3mL水溶液灌胃4周；（3）HHcy大鼠叶酸、B12 治疗组（D组） 给予3%蛋氨酸饲料喂养，且定时给予叶酸 0.5mg/（kg•d）和B12 0.2mg/（kg•d），0.3mL水溶液灌胃。A、B组则给予生理盐水0.3 mL灌胃4周。

二、方法

（一）Hcy测定

大鼠内眦静脉采血，分离血浆，采用酶联免疫法（ELISA）测定各组的tHcy含量。试剂盒（上海丰翔生物科技公司提供），严格按照说明书操作

（二）阿朴吗啡实验（APO）

择一安静的实验室，分组将每只大鼠置于玻璃器皿中，在颈项背部皮下注射阿朴吗啡（Sigma公司）100μg/ kg。注射后观察30 min，并予以记录A、B、C、D组阴茎勃起次数。阴茎头充血及末端阴茎体露出为勃起1次。

（三）大鼠阴茎海绵体内压（ICP）的测定

用戊巴比妥钠（35mg/kg）腹腔注射麻醉，正中切口，分离下腹下神经及盆神经和海绵体神经通过电极刺激海绵体神经。参数：频率：2ms，强度：5V，波宽：25Hz，持续时间：1min，间隔5min，共3次。

（四）大鼠阴茎海绵体NOS的测定

匀浆阴茎海绵体后，取上清液，用ELISA法测定各组NOS水平，试剂盒购自（上海丰翔生物科技公司），严格按照说明书进行操作。

（五）统计学分析

实验数据采用SPSS17.0统计软件包处理，结果以均数标准差（±s）表示，组间比较行方差分析及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、HHcy大鼠模型的建立

3%蛋氨酸饲料喂养4周后，通过检测tHcy浓度和APO实验建立模型组。A、B两组tHcy浓度和APO实验。进行蛋氨酸饲养四周后，B组大鼠的勃起次数低于正常组，tHcy浓度明显高于正常组，有统计学差异（P＜0.05）； B组大鼠ICP测定值明显低于正常组，C组、D组ICP测定值与B组比较ICP值升高（P＜0.05）；B组与A组比较勃起功能下降，（P＜0.05）。C组、D组与B组比较勃起功能提高（P＜0.05）。与B组比较，C组、D组大鼠tHcy浓度下降（P＜0.05），阴茎海绵体内NOS活性、H2S含量升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠勃起次数、ICP 、tHcy 、NOS、H2S的测定结果。

二、各组大鼠tHcy和阴茎海绵体内NOS、H2S含量数值与H2S进行线性相关性分析

大鼠tHcy水平和阴茎海绵体内NOS、H2S含量成负性相关，见表2。

表2 4组大鼠tHcy值与ICP相关性分析的相关系数

讨 论

HHcy是心血管疾病的独立致病因素之一，有研究表明［2］，高蛋白，高糖饮食可以引起HHcy。HHcy不仅能降低内皮细胞功能，并可以诱导血管平滑肌细胞增生，使血管硬化，促使内皮小血栓形成，还可以诱导巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白，加重粥样硬化，进而导致ED［3］，本实验结果中，HHcy大鼠勃起次数减少、ICP降低，证实了上述的理论。目前的研究提示［4］，阴茎的勃起是阴茎海绵体内的血管在神经和体液系统的调节下进行的血流动力学改变的结果。NO在这个过程中担任重要的信使作用［5］，是在NOS的调解下通过L-Arg-NO-cGMP途径实现的。桂士良等［6］在研究糖尿病HHcyED大鼠时，发现高同型半胱氨酸血症的大鼠的阴茎海绵体中的NOS的含量减少。由此可见，HHcy可以导致阴茎海绵体中NO含量下降，继而影响阴茎的勃起。

H2S是继NO和CO后的又一种气体信号分子。在人体中，H2S以结合形式存在是少于1/5的，余下的则以硫氢化钠（Sodium hydrosulfide，NaSH）的形式存在。NaSH既能水解又可以与H+结合，达到既可以维持在人体中的正常浓度，又可使内环境及pH值平稳的作用。因其具有较强的脂溶性，可以穿过细胞膜［7］，所以具有NO，CO类似的生理作用。H2S可以在细胞间传递信息，通过各种调节和信号传导方式引起血管的舒张和平滑肌的松弛［8］。H2S作为第三种气体信号分子，对心血管具有保护作用。同时与Hcy联系紧密。 可以保护蛋氨酸代谢过程中Hcy所引起的血管内皮损伤，并对Hcy所引起的细胞损害也具有保护作用。在人体中正常范围中的H2S对血管内皮系统和平滑肌系统同样有调节作用，与NO，CO关系密切。H2S与NO，CO一样在调节阴茎勃起过程中，也担任着重要的角色［9-11］。有实验［12］将大鼠的主动脉和硝普钠一起孵育后，证明H2S浓度依赖于硝普钠的浓度增加。再应用鸟苷酸环化酶抑制剂后，给予硝普钠，则H2S减少。在给予左旋精氨酸抑制剂后，发现大鼠血压增高，CSE的活性下降，血浆中的H2S浓度降低。因此，推测NO对H2S的调节主要是通过cGMP途径，实现对CSE的调节的，NO可以直接增加CSE的转录，增加表达，增强其的活性。当大鼠肺动脉高压时，有人发现H2S/CSE与NO/NOS的作用为负性调节［13］。这就说明，NO和H2S之间的相互作用很复杂，需要进一步研究。

随着对ED和阴茎勃起理论研究逐步深入，Srilatha等［14］提出H2S在阴茎勃起中有和NO、CO相似的作用；阴茎海绵体可以将Hcy转化为H2S，进而达到促进阴茎勃起的作用。这表明H2S在阴茎勃起中亦担任着信使的作用。本实验中观察到大鼠阴茎海绵体中H2S浓度的降低与tHcy有相关性。提示阴茎海绵体中H2S浓度的降低可能是HHcy所致ED的发病机制之一。

Bet作为药物单独或联合其他药物治疗HHcy已经应用于临床多年。本研究在Bet能否改善HHcy所致的ED方面进行了尝试。有学者研究2型糖尿病大鼠时，发现HHcy与勃起功能障碍有关，并提出HHcy是勃起功能障碍的发病机制之一［6］。Bet可以有效的降低HHcy伴高尿酸症患者的tHcy浓度［15］。减轻了HHcy对血管系统，血管内皮系统和神经系统的影响［16］。从而达到改善HHcy所致ED的阴茎勃起功能的效果。本试验中观察到，Bet在治疗HHcy所致的ED方面优于叶酸、维生素B12 。

综上所述，本研究表明HHcy大鼠tHcy与阴茎海绵体内NOS和H2S的具有相关性，Bet在治疗高蛋氨酸饮食引起HHcy的阴茎勃起功能下降时效果优于叶酸、维生素B1，可能是治疗HHcy所致的阴茎勃起功能下降的有效手段之一。

1 Kanth VV， Golla JP， Sastry BK， et al. Genetie interactions between MTHFR（C677T）， methionine（A2756G， C2758G）varian with vitamin B12 and folic acid determine susceptibility to premature coronary artery disease in Inian population. J Cardiovase Dis Res 2011； 2（3）: 156-163

2 陈庆军， 曹会峰， 张东升， 等. HHcy大鼠阴茎海绵体内NOS和CO含量的研究. 中华男科杂志 2008； 14（8）: 701-703

3 Hosoki R， Matsuki N， Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 1997； 237（3）: 527-531

4 Factor SH. More study needed on morning erections and erectile dysfunction. Am J Med 2009； 122（2）: e5

5 Sweazea K，Wslker BR.Antioxidant and vasodiatory effects of heme oxygenase on mesenteric vasoreactivity following chronic hypoxia. Microcirculation 2009； 16（2）: 131-141

6 桂士良， 曹会峰， 迟宝进， 等. 2型糖尿病大鼠血浆同型半胱氨酸与阴茎海绵体内NOS和内源性CO的相关性研究. 中华男科学杂志 2012； 18（2）: 126-129

7 Hu X， Li T， Bi S， et al. Possible Role of Hydrogen Sulfi de on the Preservation of donor rat heart. Transplant Proc 2007； 39（10）: 3024-3029

8 Wang R. Two's company. three's a crowd :can H2S be the third endogenous Gaseous transmitter. FASEB J 2002；16（13）: 1792-1798

9 Al-Hunayan A， Thalib L， Kehinde EO， et al. Hyperhomocy-terinemia is a risk factor for erectile dysfuction in men with adultonset diabetes mellitus. Urology 2008； 71（5）: 897-900

10 Szele FG， Murphy DL， Garrick NA. Effects of fenfi uramine，chloral phenyl piperazine， and other serotonin-related agonists and antagonists on penile erections in nonhuman primates. Life Sci 1988； 43（16）: 1297-1303

11 Pearson RJ， Wilson T，Wang R. Endogenous hydrogen sulfi de and the cardiovascular system: What's the smell all about？ Clin Invest Med 2006； 29（3）: 146-150

12 Zhao W， Zhang J， Lu Y， et al. The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener. EMBO J 2001； 20（21）: 6008-6016

13 张清友， 杜军保， 张春雨， 等. 内源性一氧化氮对低氧大鼠肺动脉硫化氢胱硫醚-γ-裂解酶体系的影响. 实用儿科学临床杂志 2003； 18（11）: 865-867

14 Srilatha B， Adaikan PG， Li L， et al. Hydrogen sulfi de: A novel endogenous gasotransmitter facilitates erectile function. J Sex Med 2007； 4（5）: 1304-1311

15 Olthof MR， Verhoef P. Effects of betaine in take on plasma homocysteine concentrations and consequeces for health. Curr Drug Metab 2005； 6（1）: 15-22

16 Craig SA.Betaine in human nutrition. Am J Clin Nutr 2004； 80（3）: 539-549

（2015-06-02收稿）

Relevance study of total homocysteine to NOS and endogenous H2S in penile corpus cavernosum of hyperhomocystinemia rats*

Gui Shiliang1，2△， Teng Fei3△， Cao Huifeng2， Chi Baojin2，Luo Zhenguo2， Guo Yugang2， Du Conglin2， Cui Dawei2， Wu Changli1**
1. Department of Urology， the Second Affi liated Hospital Tianjin Medical College，Tianjin， 300211， China； 2. Department of Urology， the First Affi liated Hospital， Jiamusi University； 3. The Affi liated Hospital， Jilin College of Pharmacy Corresponding author: Wu Changli， E-mail: wucl2003@163，com

Objective To study the effects of Bet on erectile function by total homocysteine， NOS and endogenous H2S in penile corpus cavernosum of hyperhomocystinemia rats. Methods Forty-fi ve Wistar male rates were included in the study. Ten of them were randomly selected as the control group （group A ； n=10） and were normally fed. To develop HHcy rats， other rats were fed with 3% methionine diet， then 30 rats of them were randomly divided into three groups as follows: HHcy rats group （group B， n=10）， Betaine treated group （group C， n=10） and folic acid and vitamin B12 treated group （groupD， n= 10）. Four weeks later， ICP were examined， and the levels of the total plasma homocysteine were measured using cycle enzyme， additionally， NOS activity and H2S concentration was examined in penile homogenate. Results Compared with that of group A， the level of plasma tHcy significantly was increased in group B， but the NOS activity and H2S concentration in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were decreased signifi cantly （P＜0.05）. Compared with that of group B， the level of plasma tHcy was signifi cantly decreased in group C and group D， but the NOS activity，H2S concentration in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were signifi cant increased （P＜0.05）， moreover，tHcy was negatively correlated with NOS activity （rA= -0.857， rB= -0.976， rC= - 0.903， rD= -0.847） and H2S concentrations （rA= -0.857， rB= -0.976， rC= -0.903， rD= -0.847）， respectively. Compared with that of group D， the level of plasma tHcy in group C signifi cantly decreased， whereas， the NOS activity， H2S concentrations in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were also decreased （P＜0.05）. Conclusion High level of plasma tHcy， and low NOS activity and H2S level in the penile corpus cavernous may result in the ocurrence of ED. Betaine may be an effective agent that improves the erectile dysfunction.

Betaine； Hyperhomocystinemia； Hydrogen sulphide； Nitric oxide synthetase； erectile dysfunction

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.003

R 698.1

△并列第一作者

资助: 黑龙江省自然科学基金（项目编号：H2015073）； 黑龙江省教育厅科学技术研究项目（项目编号：12521542）； 佳木斯大学重点项目（项目编号：Sz2013-005）

**通讯作者， E-mail: wucl2003@163，com