丹参酮ⅡA对压力超负荷大鼠心肌肝细胞生长因子表达的影响

蔡辉 张蓓蓓 张静 赵智明 赵凌杰 常文静 董晓蕾

基础研究

丹参酮ⅡA对压力超负荷大鼠心肌肝细胞生长因子表达的影响

蔡辉 张蓓蓓 张静 赵智明 赵凌杰 常文静 董晓蕾

目的 探讨丹参酮ⅡA磺酸钠（STS）对压力超负荷大鼠肝细胞生长因子（HGF）表达的影响。方法 采用腹主动脉缩窄法制备压力超负荷心肌纤维化（MF）模型。SD大鼠随机分为假手术组（Sham组，8例）、模型组（Model组，7例）、卡托普利组（Captopril组，7例）、STS高剂量组（STS-H 组，7例）和STS低剂量组（STS-L组，8例）。术后8周末，测定各组大鼠左心室质量指数（LVMI），观察心肌病理学改变，计算纤维化面积，碱水法检测羟脯氨酸（HYP）含量，免疫组化分析HGF、基质金属蛋白酶9（MMP9）和组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）的表达。结果 与Model组比较，Captopril组、STS-H组和STS-L组LVMI、心肌HYP含量、CVF及PCVF均有不同程度的降低（P<0.01或P<0.05），心肌MMP9和TIMP1免疫组化染色MOD值显著下降（P<0.01或 P<0.05），而 MMP9/TIMP1比值显著升高（P<0.01或 P<0.05）。Captopril组（0.062±0.007）、STS-H组（0.061±0.006）和 STS-L组（0.038±0.005）HGF免疫组化染色 MOD 值较 Model组（0.031±0.005）显著升高（P<0.01或P<0.05）。结论 STS可通过上调心肌组织HGF的表达改善压力超负荷大鼠的心肌纤维化。

丹参酮ⅡA；压力超负荷；心肌纤维化；肝细胞生长因子

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是以心脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中胶原纤维过量沉积为主的病理改变，是引起各种心律失常和慢性心力衰竭的重要原因。研究表明[1]，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一种高效的生物活性因子，对心脏具有强大的保护作用。心肌组织局部HGF表达降低与MF密切相关，且外源性HGF能通过多种途径起到抗MF的作用[2]。丹参酮ⅡA是活血化瘀中药丹参的主要有效成分之一。自钱名堃等人制成水溶性衍生物丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS）以来，对其心血管药理活性的研究不断深入，STS注射剂现已广泛用于冠心病、心绞痛和心肌梗死等心血管疾病的临床治疗。本实验拟观察压力超负荷MF大鼠局部HGF表达的变化及STS对其的影响，为MF的防治提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级6周龄雄性SD大鼠60只，体质量（BM）（180±20）g，由南京军区南京总医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK（苏）2003-0032。

1.2 药品及试剂 STS注射剂（2 ml/10 mg）购自上海第一生化药业有限公司，卡托普利片（12.5 mg/片）购自中美上海施贵宝制药有限公司，基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、组织金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP1）和HGF一抗购自武汉博士德生物公司，辣根过氧化酶标记的IgG二抗、EliVision plus免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，羟脯氨酸测定试剂盒购自南京凯基生物技术发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 采用腹主动脉缩窄法制备压力超负荷模型。所有大鼠术前禁食12 h，按照随机数字表法抽取8只作为Sham组，剩下52只作为手术组。手术组在肾动脉上方0.5 cm用直径0.70 mm银夹夹闭，使腹主动脉缩窄60%～70%；而Sham组仅分离，不夹闭腹主动脉。手术4周后，将存活的39只手术组大鼠分为模型组（Model组，n=10）、卡托普利组（Captopril组，n=9）、STS高剂量组（STSH 组，n=10）及 STS低剂量组（STS-L 组，n=10），分别给予生理盐水（2 ml·kg-1·d-1，腹腔注射）、卡托普利片（100 ml·kg-1·d-1，灌胃）、STS 注射剂（20 ml·kg-1·d-1，腹腔注射）和 STS 注射剂（10 ml·kg-1·d-1，腹腔注射）。Sham 组（n=8）予生理盐水 2 ml·kg-1·d-1腹腔注射。

1.3.2 心脏质量指数（HMI）检测 药物干预4周后，实验大鼠共存活37只，死亡10只（其中Model组3只、Captopril组2只、STS-H组3只、STS-L组2只），死亡原因为严重心衰。麻醉完全后打开胸腔，剪取心脏，除去心房及大血管，称取心脏质量（heart mass，HM），分离左右心室，称取左心室质量（left ventricular mass，LVM）。计算 HMI=HM/BM和LVMI=LVM/BM。透壁剪取左室心尖部分组织投入液氮中，其余标本放在4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.3 左室心肌病理学分析 心肌标本固定24 h后，脱水、石蜡包埋，沿左室长轴线每隔1 mm横断面切取数张厚4 μm的切片，做HE和Masson染色。光镜下观察组织形态，采用专业图片分析软件Image-Pro Plus 6.0测定纤维化面积。以视野中所有蓝色胶原（Masson染色：胶原纤维呈蓝色，心肌细胞呈红色）面积之和（不包括血管周围胶原面积）除以心肌纤维和结缔组织面积总和，计算左心室间质胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。以血管周围胶原面积除以血管面积，计算血管周围胶原容积分数（perivascular collagen volume fraction，PCVF）。

1.3.4 羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量测定 准确称取60 mg心肌组织放入试管中，按照HYP试剂盒说明书以碱水解法提取蛋白，比色法检测样品吸光度，按照下式计算羟脯氨酸含量。

1.3.5 免疫组织化学法检测心肌HGF、MMP9和TIMP1的表达 心肌切片脱蜡，乙醇梯度脱水，柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复。灭活过氧化物酶，加入一抗孵育过夜，加入HRP标记的二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水并封片。光镜下观察组织中蛋白的表达情况，细胞质中黄色为表达阳性，每张切片随机取5个视野拍照。用Image-Pro Plus 6.0测量蛋白表达的平均光密度（MOD），即阳性累积光密度除以照片总面积。

1.4 统计学方法 用SPSS 19.0软件进行分析。计量数据以±s表示。各组均数间比较采用单因素方差分析（One-Way AVONE）；两组间均数比较，方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett′s T3检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HMI、LVMI和心肌 HYP含量的比较 与Sham 组相比，Model组HMI、LVMI和心肌HYP含量显著增高（P<0.01）。与Model组相比，Captopril组、STS-H 组、STS-L 组大鼠 HMI、LVMI和心肌HYP含量均有不同程度的降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠HMI、LVMI和HYP含量比较（±s）

表1 各组大鼠HMI、LVMI和HYP含量比较（±s）

注：HMI：心脏质量指数；LVMI：左心室质量指数；HYP：羟脯氨酸。与 Sham 组相比，aP＜0.01；与 Model组相比，bP＜0.01，cP＜0.05

组别例数HMI（mg/kg）LVMI（mg/kg）HYP（μg/g）Sham 组 8 2.63±0.13 2.08±0.11 456.95±125.09 Model组 7 3.23±0.25a 2.75±0.20a 858.58±144.95aCaptopril组 7 2.82±0.32b 2.29±0.29b 482.88±29.23bSTS-H 组 7 2.88±0.20b 2.36±0.20b 520.67±174.62bSTS-L 组 8 3.00±0.27c 2.50±0.18c 580.40±174.62c

2.2 心肌病理学分析 与Sham组比较，Model组大鼠心肌纤维增粗且排列紊乱，间质和血管周围大量蓝色胶原沉积。与Model组比较，Captopril组、STS-H组和STS-L组心肌纤维情况明显改善，间质和血管周围纤维化面积明显减少。图1（左HE染色，右Masson染色）显示了各组大鼠心肌病理学改变。经过计算（图2 A，B），与Sham组比较，Model组CVF和PCVF显著升高（P<0.05）；与Model组比较，Captopril组、STS-H组和 STS-L组 CVF和PCVF明显下降（P<0.01）。

2.3 各组大鼠心肌MMP9和TIMP1免疫组化结果 与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织MMP9和TIMP1阳性表达区域明显增多，半定量分析结果显示，二者MOD值显著升高（P<0.01），MMP9/TIMP1值显著下降（P<0.01）。与Model组比较，Captopril组、STS-H组和STS-L组MMP9和TIMP1阳性表达区域减少，MOD值均有所下降（P<0.01），而 MMP9/TIMP 值升高（P<0.01，P<0.05）。见图3。

3.4 各组大鼠心肌HGF免疫组化结果 与Sham组比较，Model组大鼠心肌HGF阳性表达明显减少，MOD值显著降低（P<0.01）。与Model组比较，Captopril组、STS-H组和STS-L组心肌HGF阳性表达呈上升趋势（P<0.05，P<0.01），MOD 值显著升高（P<0.01）。见图4。

3 讨论

MF和左心室肥厚是高血压左室重构的主要特点。近年来，活血化瘀中药抗心室重构的作用已越多越多地受到关注。现代药理研究证实，丹参对心血管疾病有良好的疗效，TanⅡA作为有效成分之一对防治心室重构显示出明显的优势。除了通过抑制Ca2+通道改善心室肥厚[3]，丹参酮ⅡA还能通过抗炎、抗氧化、抑制心脏成纤维细胞（cardiac fibroblast，CFB）向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）分化[4]等作用改善MF。我们前期的研究也证实了这一点[5]。

本实验采用腹主动脉缩窄法建立压力超负荷MF模型，除了通过升高血压，增加左室射血阻力外，还通过减少肾脏血流、激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，引起手术组大鼠左室重构。手术8周末，Model组大鼠LVMI显著增加，提示左心室肥厚的存在，HYP、CVF和CVF水平升高，提示MF模型建立；并且纤维化心肌局部HGF的表达和MMP9/TIMP1值明显降低。STS可明显改善压力超负荷大鼠MF和左室肥厚，其疗效与阳性对照药物卡托普利无显著差别，与文献报道一致[6]。

大量研究发现，HGF与c-Met受体结合能防治多个器官的纤维化病变[7,8]。Yi等[9]发现，HGF/c-Met信号通路对成年小鼠心脏具有保护作用。心脏发生损伤时，血浆中HGF水平反馈性升高，一方面抑制心肌细胞肥大和凋亡[10]，保护心肌收缩力；另一方面，抑制CFB增殖、分泌和分化，改善心脏舒张功能。Arechederra等[11]的研究发现，HGF可以下调Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白在转化生长因子-β1处理过的 CFB的表达水平。Okayama等[12]报道，HGF通过抑制冠状动脉内皮-间充质细胞转变和CFB-MFB分化，分别改善血管周围纤维化和心肌间质纤维化。

ECM对维持左心室形态和功能至关重要。MMPs是降解ECM的关键酶，其活性主要受到TIMPs的拮抗。MMP9即明胶酶B，主要水解变性胶原，是参与高血压左室重构重要的MMPs[13]。TIMP1可与MMP9的酶原或活化后酶催化区的羧基末端以1∶1比例共价结合，形成复合体，是MMP9特异性抑制剂，故二者的比值在胶原代谢中的作用显然更为重要。本实验发现，纤维化心肌组织MMP9和TIMP的表达均上升，但MMP9/TIMP1值降低。Polyakova等[14]的研究发现，与心功能正常人比较，扩张型心肌病、缺血性心肌病和心肌炎所致心功能Ⅳ级患者心肌MMP9和TIMP1均上升，总MMP/总TIMP也上升，但胶原合成均大于降解，与本研究部分结果具有一致性。Bonnema等[15]报道，随年龄增长，血浆MMP9水平呈下降趋势，而TIMP1水平呈上升趋势，故推测年龄因素或许是影响MMP9、TIMP1表达的原因之一。还有研究发现[16]，对于高血压左室肥厚患者，离心性肥厚与向心性肥厚也是导致血清MMP9、TIMP1的表达及比值在不同研究中相悖的重要原因。

综上所述，STS抑制压力超负荷大鼠MF的作用机制至少与上调心肌局部HGF的表达有关。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色（×400）及Masson染色（×200）结果

图2 各组大鼠心肌间质和血管纤维化面积结果

图3 各组大鼠心肌组织MMP9和TIMP1免疫组化半定量结果

图4 各组大鼠心肌HGF的免疫组化染色结果

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Effect of TanshioneⅡA on expression of hepatocyte growth factor in pressure overloaded rats

CAI Hui，ZHANG Bei-bei，ZHANG Jing，et al.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military command，Nanjing 210002，China

CAI Hui，E-mail：njzy_caihui@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate（STS）on expression of hepatocyte growth factor in pressure overloaded rats.MethodsPressure overloaded myocardial fibrosis models were established by abdominal aortic constriction.The SD rats were randomly divided into 5 groups:Sham group（n=8），Model group（n=7），Captopril group（n=7），STS-H group（n=7） and STS-L group（n=8）.8 weeks after operation，left ventricular mass indexes of rats in each group were measured，pathological changes of the myocardium were observed，the collagen volume fractions and hydroxyproline content were calculated， the expression levels of myocardial MMP9，TIMP1 and HGF were analyzed by immunohistochemistry.ResultsCompared with the Model group，the left ventricular mass indexes，myocardial hydroxyproline content and collagen volume fractions were markedly relieved，as well as expression levels of MMP9 and TIMP1 were significantly decreased（P<0.01，P<0.05），but the ratio of MMP9/TIMP1 were obviously increased（P<0.01，P<0.05）.The MOD values of HGF immumohistochemical staining in Captopril group（0.062±0.007），STS-H group（0.061±0.006）and STS-L group（0.038±0.005）compared with Model group（0.031±0.005）were obviously increased（P<0.01，P<0.05）.ConclusionSTS can improve myocardial fibrosis in pressure overloaded rats，which may be related with the up-regulation of HGF expression level at least.

TanshinoneⅡA；Pressure overload；Myocardial fibrosis；Hepatocyte growth factor

南京军区南京总医院科研基金（项目编号：2014016）

作者单位：210002 江苏省南京市，南京军区南京总医院中西医结合科

蔡辉，E-mail：njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.06.021

Q95-33；R542.2+3

A

1672-5301（2015）06-0567－04

2015-02-11）