家蚕黑胸败血病病原菌的分离鉴定

覃玥等

摘要：从广西宜州蚕区暴发黑胸败血病的养蚕农户处采集到病蚕样本，分离到1株病原菌，通过形态学观察和回复感染健康5龄家蚕试验及16S rDNA基因序列同源性分析鉴定，结果显示病原菌菌落呈橘黄色，光滑，圆形，边缘整齐，有光泽，湿润有黏性，革兰氏染色呈阳性，该菌形态学符合葡萄球菌属的特征；用菌液穿刺感染健康5龄家蚕10 h后蚕体胸部膨大，痉挛侧倒而死，11 h后胸部变黑呈现黑胸败血病病症；从腹腔接种菌液的小白鼠16 h内全部发病，从发病的家蚕体液和死亡小鼠的心血均能分离到与接种菌株形态一致的细菌，证实该菌为引起家蚕黑胸败血病的病原菌。菌株16S rDNA片段为1 463 bp（GenBank ID：1811543），与GenBank数据进行比较，该菌株与松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）同源性为99.9%，鉴定该菌株为松鼠葡萄球菌。

关键词：家蚕细菌病；黑胸败血病；松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）；16Sr DNA；分子鉴定

中图分类号：S884.4+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4529-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.034

细菌病是养蚕生产中最常见的病害，研究发现对家蚕有致病性的病原细菌主要有葡萄球菌属（Staphylococcus）、沙雷氏菌属（SerratiaBizio）、气单胞菌属（Aeromonas）、肠杆菌属（Enterobacter Hormaeche and Edwards）、假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Streptococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）[1]。黑胸败血病是常见的家蚕细菌病之一，文献报道其病原主要是芽孢杆菌属，发病典型症状是在胸部背面或胸腹之间出现黑色斑，很快全身变黑腐烂。广西宜州市是中国最大的桑蚕生产地，多批次养蚕模式及高温多湿的气候使蚕病的发生非常严重，蚕农防治家蚕细菌病主要使用抗生素类药物，抗生素的不科学使用容易造成家蚕病原菌耐药性增强，导致耐药菌株产生[2]，对桑蚕业的健康发展造成很大的威胁，同时细菌在生长繁殖过程中发生诸如大小改变、结构变化及毒力增强或减弱等的变异现象。2012年6月，宜州市某养蚕户2张5龄第四天蚕暴发细菌病，发病率高达40%，从发病症状判断为家蚕黑胸败血病，为了明确引起该例家蚕黑胸败血病的病原及其特性，采集了家蚕黑胸败血病蚕样并分离其病原菌进行形态学观察、革兰氏染色、回复感染健康5龄家蚕试验及分子生物学鉴定，旨在明确其病原菌的分类地位和特性，为蚕病的防控、蚕药的合理使用及新药研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试家蚕

家蚕黑胸败血病样本从广西宜州市某农户家采集，表现为侧倒死亡，胸部背面和胸腹之间出现黑色斑；健康5龄家蚕是两广2号，河池学院桑蚕研究所提供；昆明种小白鼠购自广西医科大学实验动物中心，每只体重约20 g。

1.2 试剂

PCR反应试剂、Marker、连接酶、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司。

1.3 病原菌的分离纯化

用75%乙醇对病蚕体表消毒，刺破体壁取体液，用无菌水稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，30 ℃培养16 h，挑取单个优势菌落进一步纯化培养，观察菌落形态特征，并进行革兰氏染色，观察细菌的形态和染色结果[3，4]。

1.4 细菌回复感染蚕体试验和病原菌致病力的检测

分离菌株编号为Cqy201201，将其接种于细菌培养基，30 ℃振荡培养16 h，用分光光度计测菌液浓度，取1.62×106 CFU/mL的半数致死量菌液回复穿刺健康5龄家蚕体壁作回归试验，取60只健康5龄家蚕，均分成甲、乙两组，甲组每只蚕从体壁注射接种2 μL菌液，乙组注射无菌生理盐水作对照，接种后两组均投桑叶置于28 ℃饲养。取健康小白鼠12只平均分成2组，其中1组为感染组，每只小白鼠腹腔接种0.1 mL菌液，对照组每只小白鼠腹腔注射0.1 mL无菌生理盐水。观察、记录家蚕和小白鼠发病情况及死亡时间[5]，并对濒死的家蚕和试验鼠进行细菌分离、培养和鉴定。

1.5 细菌的16S rDNA基因扩增鉴定

用DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA作为PCR模板扩增16S rDNA序列，参照文献[5]设计细菌16S rDNA通用引物，上游引物16SF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物16SR：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，反应体系为：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL， 10 μmol/L 16SF 1 μL，10 μmol/L 16SR 1 μL，基因组DNA（20～50 ng/μL）1 μL，加9.5 μL ddH2O至总体积为25 μL；反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应 。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI进行Blast比对鉴定菌株。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学特征

从表现家蚕黑胸败血病的家蚕体液中分离纯化的菌株（编号为Cqy201201）菌落呈圆形、黄色、光滑、不透明、边缘整齐、有光泽、湿润有黏性等特征，色素不扩散到培养基中（图1），革兰氏染色呈阳性（图2），无芽孢，无荚膜，不运动，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版描述的菌落形态特征，该菌形态学符合葡萄球菌属的特征。

2.2 细菌回复感染和致病性测定

用Cqy201201菌液通过穿刺感染健康5龄家蚕6 h后，试验组家蚕开始停食，躯体挺直，行动呆滞，头尾翘起，腹部向腹面拱出，腹足后倾，随着时间的推移，胸部开始膨大，蚕体的病症逐渐加重，10 h后，腹部各环节收缩，痉挛侧倒而死，11 h后蚕体胸部出现黑色斑，13 h后蚕体全身变黑（图3），该症状与蚕农家采集到的黑胸败血病蚕体症状相同，对照组则无异常。从腹腔接种0.1 mL菌液的小白鼠16 h内全部发病，表现昏睡、眼流泪等症状，24 h后全部死亡，对照组小白鼠48 h无发病，从发病的家蚕体液和死亡小鼠的心血和肝脏均能分离到与接种菌株形态一致的细菌，说明该菌为引起家蚕黑胸败血病的病原菌。

2.3 PCR扩增16S rDNA序列分析结果

以菌株基因组DNA为模板，用16S rDNA基因通用引物16SF/16SR扩增得到Cqy201201菌株16S rDNA片段， PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳，呈现约1.5 kb的条带（图4），与预期结果相符，测序结果为1 463 bp（GenBank ID：1811543），将菌株Cqy201201的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行Blast相似性搜索，其序列同源性最为接近的菌株均为葡萄球菌属，与松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）16S rDNA基因序列有高达99.9%的同源性，表明Cqy201201为松鼠葡萄球菌属。

3 讨论

本研究从出现黑胸败血病较为严重的农户家的病蚕体分离到1株松鼠葡萄球菌，人工感染试验证实其对健康5龄家蚕和小白鼠均有较强的致病性，并表现出与自然感染相似的临床症状与病理变化，而且从人工感染的病死蚕和小鼠体内再次分离到与原致病菌株形态特征一致的单一菌株，由此证实菌株Cqy201201是该病的致病菌株。对Cqy201201进行了16S rDNA的克隆与序列分析，结果显示Cqy201201与S.sciuri代表株CTSP9 16S rDNA序列的同源性最高，为99.9%，因此可从分子水平上将菌株Cqy201201鉴定为松鼠葡萄球菌。

松鼠葡萄球菌属是葡萄球菌科的成员之一，Kloos等[6]1976年首次报道，为条件性致病细菌，该菌能够引起黄鳝鱼[7]、黄喉拟水龟[8]等多种动物的急性传染病，发生大批量的死亡，造成养殖户巨大的经济损失，也有引起山羊和奶牛乳房炎，猪渗出性皮炎等动物疾病的报道[9，10]。松鼠葡萄球菌也是外伤感染的主要病原，能引起人的心内膜炎、腹膜炎、败血症、尿道感染、盆腔炎症和伤口感染等多种疾病[11-14]，研究发现ExhC是松鼠葡萄球菌致病机理中的关键因素之一。松鼠葡萄球菌引起家蚕黑胸败血病尚未见报道，一直认为引起家蚕黑胸败血病主要病原是芽孢杆菌[15，16]，从发病到死亡约12～20 h，死后3～4 h出现黑斑。本试验分离到的松鼠葡萄球菌引起黑胸败血病的家蚕从发病到死亡约为11 h，死后2 h出现黑斑，生产上更容易造成家蚕大批量死亡，说明该菌具有较强的致病能力。

松鼠葡萄球菌病是一种环境性致病菌，控制和防范措施主要是防止及减少家蚕外伤的发生，注意做好养蚕前的消毒工作。在明确广西宜州市蚕区家蚕黑胸败血病的病原菌特征后，进一步的工作是研究蚕药及中草药对该菌的防治效果，科学合理地防治该病的发生，控制家蚕细菌病病害流行和蔓延。

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