高效液相色谱法测定甲磺酸伊马替尼原料药含量

严拯宇， 刘新颖， 王丽丽， 廖声华

(中国药科大学理学院，江苏南京 211198)

甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)，商品名格列卫(Glive)，是由瑞士Novartis公司研发的第一代酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)，并作为全球第一个获得批准的肿瘤发生相关信号传导抑制剂进入临床应用。该药于2001年5月被英国食品药品管理局(U.S.Feod and Drug Adninstration,FDA)批准用于治疗慢性粒细胞白血病，2003年被批准用于治疗胃肠道间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tunor,GIST)，治疗效果得到广泛认可。目前，关于甲磺酸伊马替尼的合成[1,2]及临床应用[3]的研究较多，而对于该药质量控制的研究并不多见，各国药典均未收录其原料和制剂的检测方法。现有文献报道的高效液相色谱(HPLC)法测定甲磺酸伊马替尼含量的方法中[4 - 7]，流动相多添加三乙胺或离子对试剂辛烷磺酸钠，流动相难平衡，重现性差。

本文在参考文献方法[8]的基础上，建立了HPLC法测定原料药中甲磺酸伊马替尼含量的方法，并参照《中国药典》(2010版)有关要求进行了方法学验证，证实该方法简便易行，准确度高，重现性好。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪(日本，岛津公司)，配置SPD-M20A型二极管阵列检测器(DAD)；BS124S型电子天平(德国，赛多利斯科学仪器有限公司)。

甲磺酸伊马替尼对照品(含量以干燥品计为99.6%)；甲磺酸伊马替尼原料药(批号：20140303，20140403，20140503)，已知杂质：(1)4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)苯甲酸二盐酸盐；(2)N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺；(3)4-[(4-甲基-1-氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(4)4-[(4-甲基-1，4--氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(5)4-甲基-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-哌嗪-苯胺盐酸盐;(6)N-(5-甲氧基氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺;(7)4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(8)N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(3-吡啶基)-2嘧啶胺，均由中国药科大学医化所提供。乙腈(色谱纯，美国默克公司)；辛烷磺酸钠(色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(PBS)：取KH2PO46.8 g，加水溶解，用H3PO4调节pH至3.0，再加水至1 000 mL。实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18柱(150×4.6 mm，3.5 μm)；流动相A：0.05 mol·L-1PBS(pH=3.0)；流动相B：乙腈。梯度洗脱程序：0.0～20.0 min，95%～85%A；20.0～40.0 min，85%～70%A；40.0～50.0 min，70%～55%A；50.0～55.0 min，55%～55%A；55.0～56.0 min，55%～95%A；56.0～60.0 min，95%～95%A。柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；检测波长235 nm。

1.3 溶液制备

1.3.1系统适用性溶液的制备根据本品的合成工艺，分析原料药中可能引入的杂质，包括起始原料、中间体及已知降解杂质等多达8种(杂质1、2、3、4、5、6、7、8)。分别精密量取上述8种已知杂质及甲磺酸伊马替尼对照品适量，用稀释剂(流动相A与流动相B体积比为95∶5)稀释，制成含已知杂质2、3、4、7 浓度约为0.2 μg·mL-1、含已知杂质1、5、6、8浓度约为0.3 μg·mL-1、含甲磺酸伊马替尼浓度约为0.2 mg·mL-1的混合溶液。

1.3.2供试品及对照品溶液的制备取甲磺酸伊马替尼原料药适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含0.1 mg的溶液，作为供试品溶液。另取甲磺酸伊马替尼对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

1.3.3有关物质溶液的制备取甲磺酸伊马替尼原料药适量，加稀释剂溶解后并用其稀释制成浓度约为0.2 mg·mL-1的溶液，作为供试液；取该试液适量，用稀释剂稀释定量浓度为0.2 μg·mL-1的溶液作为对照溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1测定波长的选择根据甲磺酸伊马替尼供试品及8个已知杂质的DAD光谱扫描结果，表明样品在235 nm波长处有最大吸收，合成的起始原料、各步中间体及降解杂质的最大吸收波长按出峰顺序分别为235、235、235、235、245、245、235、274 nm，为兼顾各峰，最终选择测定波长为235 nm。

2.1.2流动相的选择实验中分别选取乙腈-PBS、乙腈-PBS-三乙胺、乙腈-PBS-辛烷磺酸钠(不同比例)作为流动相。以乙腈-PBS作为流动相时，基线平稳且分离度较好。流动相中添加三乙胺后，峰形和分离度无明显改善，但基线噪音有所增加；添加辛烷磺酸钠后，添加离子与带电分析物形成中性化合物，增加了在色谱柱上的保留。以上两种添加剂的加入均增加了色谱系统的平衡时间。

实验还考察了流动相A的pH(2.5、3.0、3.5)对分离情况的影响。随着pH的增加，各组分出峰时间延长，对已知杂质6与甲磺酸伊马替尼主峰的分离度影响较大，且主峰拖尾情况也越严重。从分离度、峰形及色谱柱的使用寿命综合考虑，本实验选择流动相A的pH为3.0。

2.2 专属性试验

图1 系统适用性溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

2.2.1系统适用性试验按1.3.1项下方法配制系统适用性溶液，按1.2节色谱条件进行测定，记录色谱图。理论塔板数按甲磺酸伊马替尼计为135 500N/m，甲磺酸伊马替尼峰与已知杂质6、已知杂质7的分离度(Rs)分别为2.5和3.7，表明系统的适用性满足要求。色谱图见图1。

2.2.2强制降解试验取甲磺酸伊马替尼供试品适量，经高温(95 ℃，1 h)、酸(加1.0 mL 1 moL·L-1HCl，室温1 h)、碱(加1.0 mL 1 moL·L-1NaOH，室温1 h)、氧化(加1.0 mL 6%H2O2，室温1 h)、光照(4 500 Lx，48 h)破坏后，用稀释剂定容，进行测定，记录色谱图，结果见图2。在酸、碱和氧化破坏下甲磺酸伊马替尼发生了降解，所产生的降解产物与主峰分离度良好，并用DAD对主峰纯度作出进一步判断，甲磺酸伊马替尼的色谱峰是纯的。说明所建方法专属性良好。

图2 甲磺酸伊马替尼与降解产物的分离色谱图Fig.2 Chromatograms of imatinib mesylate and its degradation products A.destroyed by acid;B.destroyed by alkali;C.destroyed by oxidation;D.destroyed by heating;E.destroyed by light;F.blank solvent.

2.3 线性关系考察

取甲磺酸伊马替尼对照品约20 mg(精密称定)，置于25 mL容量瓶中，用少量稀释剂溶解并稀释至刻度，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加稀释剂稀释并定容，得到标准系列溶液。按1.2节下色谱条件进行测定，记录色谱图。以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程:y=7×107x-45674(r=0.9995)。结果表明，甲磺酸伊马替尼在0.0168～0.1677 mg·mL-1范围内其浓度与峰面积的线性关系良好。

2.4 定量限和检测限

取1.3节下甲磺酸伊马替尼对照品溶液，用稀释剂逐级稀释后依法测定。以信噪比(S/N)=10计算，甲磺酸伊马替尼定量限为11 ng·mL-1；以信噪比(S/N)=3计算，甲磺酸伊马替尼检测限为3.3 ng·mL-1。

2.5 精密度与重复性

取1.3节下甲磺酸伊马替尼对照品溶液，连续进样测定6次，记录峰面积。峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.13%(n=6)，表明精密度良好。取甲磺酸伊马替尼供试品(批号：20140303)适量，按1.3节下方法平行配制6份供试品溶液，依法测定，外标法计算甲磺酸伊马替尼含量。结果显示平均含量为99.7%，RSD为0.35%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.6 溶液稳定性

按1.3节下方法，将新鲜配制对照品溶液和供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后分别进样测定，对照品溶液峰面积的RSD为1.2%(n=8)，供试品溶液峰面积的RSD为0.20%(n=8)，表明对照品溶液和供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.7 加标回收率

取已知含量的甲磺酸伊马替尼供试品(批号：20140303)适量，精密称定(9份)，分别加入甲磺酸伊马替尼对照品适量，配制其浓度分别为80%、100%、120%三个水平的供试品溶液。分别精密吸取20 μL，依法测定。以供试品加标后实际测量值减去样品测定值之差与加标量的比值作为加标回收率，得到方法的平均加标回收率为98.9%(n=9)，RSD 为 0.67%，表明方法的回收率良好。

2.8 样品测定

取干燥后的甲磺酸伊马替尼供试品(批号：20140303，20140403，20140503)及对照品适量，精密称定，按1.3节下方法分别制备含量测定溶液和有关物质检查溶液，进行测定，并记录峰面积，按外标法以峰面积计算含量，按自身稀释对照法进行有关物质的测定，3批样品的测定结果见表1。

表1 3批样品含量及有关物质测定结果(n=3)

2.9 非水滴定法与HPLC法测定甲磺酸伊马替尼含量比较

对于原料药的含量测定，我们选择非水酸碱滴定法，参照《中国药典》2010年版二部附录VII A电位滴定法的规定[9]，以冰乙酸∶醋酐(1∶8)为溶剂，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，电位法指示终点，滴定结果空白校正，并将实验结果与HPLC法进行比较，对原料药(批号：20140303，20140403，20140503)的含量进行了检测。非水滴定法测得的含量为99.4%、99.6%、99.6%；两种方法测定结果基本一致。

3 结论

本文所建立的分析甲磺酸伊马替尼原料药的HPLC方法，流动相组成简单，平衡时间短，基线平稳，可使甲磺酸伊马替尼与其他8种已知杂质全部有效分离，精密度和准确度较高，专属性较强，重现性较好，可用于甲磺酸伊马替尼原料药的含量测定。