长链多不饱和脂肪酸甘油酯分析方法研究进展

吴 琳， 魏 芳， 吕 昕， 董绪燕， 陈 洪

(中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，油料脂质化学与营养湖北省重点实验室，湖北武汉 430062)

1 前言

长链多不饱和脂肪酸(Long-chain Polyunsaturated Fatty Acids，LC-PUFAs)是指分子结构中含有两个或两个以上不饱和双键，且碳链长度为18～22个C的脂肪酸，主要有亚油酸(Leinoleic Acid，LA)、亚麻酸(Linolenic Acid，LnA)、二十碳四烯酸(Arachidonic Acid，ARA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)。其中，ARA、EPA及DHA在预防心血管疾病、降血脂、降低胆固醇、减肥等方面具有明显的作用，是大脑、眼睛和整个神经系统发挥正常功能必不可少的营养物质，对人体健康非常重要[1,2]。脂肪酸根据第一个双键距离甲基端位置的不同，可分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列，摄入适量的ω-3系脂肪酸(如EPA、DHA)可预防心血管疾病，维护神经系统健康，起到抗炎等作用；摄入ω-6系脂肪酸(如ARA)可以抑制肿瘤[3]。但摄入过多含DHA的油脂，可能会通过增强膜脂质过氧化的易感性，扰乱组织抗氧化系统，进而给机体带来不利的影响[4]。中国营养学会于2000年按年龄段对膳食中ω-6/ω-3系脂肪酸的均衡比例给出了适合中国人的平衡建议：2岁以下和60岁以上是4∶1，其它年龄是4～6∶1[5]。因此，对长链多不饱和脂肪酸进行种类及双键位置的鉴定对脂质在营养学中的研究具有重要意义。

甘油三酯(Triacylglycerols，TAGs)是脂肪酸最主要的存在形式，占食用油组成的95%以上。TAGs是由一个甘油分子与三个脂肪酸分子缩合而成，而脂肪酸在甘油三酯中甘油骨架上的位置分布有两类：sn-1/3(α)和sn-2(β)，脂肪酸在TAGs中的分布位置决定着油脂的功能特性及吸收代谢情况[6]。例如，Christensen等[7]研究发现，EPA及DHA处于sn-2位比处于sn-3位的吸收利用要有效得多。已有关于LC-PUFAs在甘油三酯中位置分布的文献报道，例如，海豹油TAGs中，PUFAs主要分布在TAGs的α位，而鱼油中多分布在β位[8 - 10]。因此，对LC-PUFAs TAGs中脂肪酸酰基位置进行剖析对于揭示LC-PUFAs 的营养学特性有着重要的意义。

随着色谱-质谱联用技术的迅速发展，使得脂质组成及其结构的高效、高准确度和高灵敏度的分析与鉴定成为可能。但是在剖析LC-PUFAs TAGs时，除了缺少必要的标准品外，还存在其他困难。因此，需要更高效的色谱分离技术和新的质谱鉴定技术的支持[11]。本文对LC-PUFAs及LC-PUFAs TAGs的色谱分离及质谱鉴定方法进行了综述，包括直接进样质谱及色谱-质谱联用技术。

2 长链多不饱和脂肪酸甘油酯的色谱分析技术

色谱技术可以快速、高效地实现脂质的分离。常用于分离脂质的色谱技术有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和超临界流体色谱法等。而用于LC-PUFAs TAGs分离的方法主要有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。

2.1 薄层色谱

薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)具有操作简单，耗资少，省时的优势，常用于脂质种类的分离。广泛用于油脂分离的TLC固定相有硅胶、氧化铝、硅藻土。近年来，一些新型材料作为TLC的固定相用于分离饱和度不同的脂肪酸甲酯。Amlund等[12]在对鱼油脂肪酸和甲基汞相互作用的营养进行评估时，采用高效薄层色谱(HPTLC)分离鱼油样品，使用粒径更小的硅胶作为固定相，得到含长链多不饱和脂肪酸的脂质。2012年，Dillon等[13]首次提出巯醇银(AgTCM)作为TLC的固定相材料，AgTCM-TLC与传统Ag-TLC都是根据固定相中的Ag+与双键的π电子之间的相互作用来分离饱和度不同的化合物，但AgTCM对光稳定性更强，薄层板寿命更长，AgTCM-TLC已成功应用于分离多种长链多不饱和脂肪酸甲酯混合物[14]。TLC法分析样品中TAG时，首先使用合适的展开剂将样品按照脂质种类进行分离；然后将TAG组分回收，再在含Ag+的硅胶板上根据TAG中羧酸基的饱和程度来进一步分离。随着TLC法与可见分光光度计的结合，使得TLC可以对TAG进行定量分析。鲍方宇等[15]采用磷钼酸作为显色剂，通过TLC与可见分光光度计相结合的技术，准确测定了混合脂肪酸组成的TAG含量，但由于该方法分离回收的效果受硅胶板的质量、展开剂、显色效果等因素的影响较大，因此一般只作为定性分析的一种辅助手段。

2.2 气相色谱

2.2.1长链多不饱和脂肪酸的气相色谱分析方法气相色谱(Gas Chromatography，GC)分析TAG时，在进样前，通常需要对TAG进行甲酯化衍生，因而甘油三酯是否完全甲酯化是准确分析油脂中脂肪酸的关键，而甲酯化衍生会导致TAG脂肪酸酰基位置分子结构信息的丢失，因此GC法主要用于TAGs脂肪酸组成的分析[16]。目前，GC已用于鱼油[17,18]、藻油[19]和微生物油脂中含LC-PUFAs TAGs的脂肪酸组成分析。2012年，Delmonte等[20]应用新型阴离子气相色谱毛细管柱SLB-IL111实现对脂肪酸异构体的分离，通过优化色谱条件，同时分离包括长链在内的多不饱和脂肪酸顺反异构体和双键位置异构体。Liu等[21]应用GC-MS对小鼠视网膜中长链多不饱和脂肪酸分析时，确定了ω-3/ω-6系脂肪酸的含量比。通过选择不同的质谱扫描模式，比较了碳链长度、双键数及双键位置对GC-MS分析脂肪酸的质谱响应的影响，结果发现全扫描模式下，随着脂肪酸不饱和度增高，质谱响应(峰面积)略微降低；而在选择离子扫描模式时，响应随不饱和度增加而增加，脂肪酸双键位置对响应的影响不明显。

2.2.2长链多不饱和脂肪酸甘油酯的GC分析方法随着高温气相色谱(HTGC)固定相的出现，气相色谱分析高沸点化合物成为可能。在柱温大于400 ℃的情况下，HTGC与MS联用，不需要将TAG进行甲酯化衍生，TAG按C数由小到大依次洗脱。但高温对不饱和度相对较高的TAGs有破坏作用，因此不适合分析LC-PUFAs TAGs。Sutton等[22]使用HTGC联用飞行时间质谱(TOF-MS)分离TAGs时，温度达到430 ℃，具有相同碳链长度的甘油酯及相同双键数(DBs)的甘油酯出现共洗脱现象，说明HTGC-MS无法实现对TAGs位置异构体的鉴定[23]。

2.3 高效液相色谱

2.3.1非水反相液相色谱由于甘油三酯不溶于水，因此液相色谱常采用非水流动相。基于十八烷基键合硅胶固定相(商品化的C18色谱柱)的非水反相液相色谱(Non-aqueous Reversed Phase HPLC，NARP-HPLC)是分析TAG最常用的技术之一。甘油三酯在C18色谱柱中的保留取决于当量碳数(Equivalent Carbon Number，ECN)，ECN等于甘油三酯中酰基链总C数(CNs)减去两倍的双键数(DBs)，即 ECN=CN-2DB。Momchilova等[24]使用End-capped Superspher RP-18(e)柱，流动相为乙腈和乙醇，梯度洗脱，将PPL/PLP，PPLn/PLnP，PPE/PEP，PPA/PAP，PPD/PDP(其中P：C16∶0，L：C18∶2，Ln：C18∶3，E：C20∶5，A：C20∶4，D：C22∶6)完全分离。通过比较4种ODS色谱柱和6种流动相对TAG保留的影响表明，脂肪酸碳链长度、双键数及不饱和脂肪酸的酰化位置是影响保留时间的主要原因。Lisa等[25]分别使用C18色谱柱及C30色谱柱分离黑醋栗油中TAGs，比较了不同流动相条件、洗脱梯度、柱温对分离结果的影响。结果表明相同条件下，C18色谱柱及C30色谱柱分析黑醋栗油中TAG时，出峰时间区别不大，但是C30色谱柱的分离效果远没有C18色谱柱的分离效果好，只能分离得到38种TAGs，而C18色谱柱可以分离得到83种TAGs；C30色谱柱与C18色谱柱相比，不能分离含α-亚麻酸和γ-亚麻酸的LC-PUFAs TAG双键位置异构体；柱温不会改变C18色谱柱分离TAG的出峰顺序，但可以改变C30色谱柱分离TAG的出峰顺序；不同初始流动相条件、不同洗脱梯度只会造成保留时间偏移，但不会影响TAG的出峰顺序。

2.3.2Ag+液相色谱Ag+液相色谱(Ag-HPLC)是一种特殊的正相色谱，常作为NARP-HPLC分离的互补方法。Ag-HPLC常用于分离TAGs异构体，其分离原理是根据固定相中的Ag+与TAG中双键的π电子之间的电荷转移作用分离TAGs，因此TAGs中双键数目及位置决定着保留时间。Holapeka等[26]通过串联三根Ag+液相色谱柱(ChromSpher Lipids,Varian,USA)分离TAGs双键位置异构体及脂肪酸酰基位置异构体，分别联用5种不同类型的质谱检测器，并对分析结果进行了比较。结果表明，检测器的类型对得到的碎片离子丰度比的影响低于脂肪酸的双键数目、双键位置及酰基链在甘油骨架中的分布位置对得到的碎片离子丰度比的影响。同时也表明串联三根Ag+液相色谱柱仍无法分离sn-2位TAG双键位置异构体(如Lα-LnL与Lγ-LnL)[27,28]。

Ag-HPLC分离TAG时的分离效率受三个因素影响：流动相组成、柱温及色谱柱性能[29]。合适的流动相能显著提高Ag-HPLC分离TAG异构体的分离效率，而柱温对TAG异构体在Ag+色谱柱中保留时间的影响相当复杂。目前Ag-HPLC使用的色谱柱主要为商品化Spher Lipids色谱柱[30]。但常规Ag+色谱柱对多不饱和TAGs的分析都表现出低重现性，且无法实现双键数大于7的TAG异构体的分离，对于双键数更多的TAGs，出峰时间很长甚至不出峰。

Leskinen等[31]通过将Ag+键合于EC 250/4.6 Nucleosil 100-5 SA色谱柱，成功分离黑加仑籽油中Ala/L/L与Gla/L/L(Ala为α-亚麻酸，Gla为γ-亚麻酸，L为亚油酸)双键位置异构体。Dillon等[32,33]将Ag+键合到3-巯基丙基固定相上制备硫醇银(AgTCM)液相色谱柱，其分离原理与Ag+的分离原理相似，都能按照双键数不同将分析物分离。由于硫醇和Ag+形成了较强的配位化合物，使得AgTCM色谱柱的稳定性及分析物保留时间的重现性较常规Ag+色谱柱更佳，但目前只应用于长链多不饱和脂肪酸乙酯的分离。

Ag-HPLC虽然可以分离TAG酰基位置异构体及双键位置异构体，但分离含EPA和DHA等LC-PUFAs TAGs位置异构体仍然是一个难题[34]，通常需要串联两根或两根以上的Ag+色谱柱，但也只能实现部分TAG异构体分离，不仅耗时，而且增加了分析成本。

表1列出了文献中已报道的不同液相色谱柱分离鉴定长链多不饱和脂肪酸甘油酯的研究及其应用。

表1 不同液相色谱柱分离长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的应用

3 LC-PUFAs TAGs的直接进样质谱鉴定技术

直接进样MS应用最广泛的电离源是电喷雾电离(Electronic Spray Ion，ESI)和基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)。MS成像技术可以提供形象化的脂肪酸分布信息，Shah等[50]应用此方法已形象化的鉴定了人血浆中不饱和度为3的TAG分子。由于其可视化的优点，常被用于生物样品分析，主要用于多种生物样品中LC-PUFAs磷脂分子分析。

3.1 电喷雾电离质谱

近年来，也有很多新型技术应用于ESI-MS中，用于鉴定LC-PUFAs TAGs。2012年，Pham等[55]首次将原子团定向解离方法应用于油脂分析，通过向TAG异构体中添加4-碘苯胺(IA)形成[TAG+IA]+，在一定的CID作用下，[TAG+IA]+发生α断裂与β-裂解，因而产生不同的碎片离子，根据这些碎片离子可鉴定TAG中脂肪酸位置和双键位置，应用该方法已成功鉴定了含亚麻酸的TAG酰基位置异构体及双键位置异构体。

3.2 基质辅助激光解吸电离质谱

近年来，MALDI-MS已越来越多用于脂质分析。同ESI-MS一样，这项技术已应用于分析磷脂[56]、TAGs[57]以及脂肪酸[58]。MALDI与ESI-MS不同的是对所有的脂质都能产生正离子，使得在一个图谱中能观察到宽范围的脂类。MALDI的优势在于其对基质的耐受性，如缓冲盐等，且适合大量样品的生物学分析。可以通过添加相应的盐产生[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等离子。Kubo等[59]采用单一同位素前体离子模式分析橄榄油中的TAG，通过高能量的碰撞诱导解离(CID)使加钠TAG产生远电荷碎裂，提高了前体离子选择性，实现TAG更完整的分析。Danielewicz等[60]利用MALDI技术分析了微藻油中TAGs的组成，鉴定出C数为18和20，双键数最高为4的多不饱和脂肪酸，同时也指出由于MALDI常与飞行时间质量分析器(TOF)联用，其灵敏度很高，对每个TAGs相似物都有响应，不适合用于定量含长链多不饱和脂肪酸的TAGs。MALDI-MS需要合适的基质才能获得好的重现性及灵敏度，其定性定量能力不如ESI-MS和大气压化学电离质谱(APCI-MS)。

4 LC-PUFA TAG不同分析方法的比较

常用于分离LC-PUFA TAG的色谱方法有：TLC、HTGC、HPLC及2D-LC。TLC具有操作简单、成本低廉、对设备要求低等优点，但利用该方法分离甘油三酯时，分离回收的效果受硅胶板、扩展剂及操作水平等因素的影响较大，且定量困难。HTGC可以直接分析TAG，TAG在耐高温的气相色谱柱上按C数由小到大依次洗脱，但长链多不饱和脂肪酸在高温下容易发生热降解，因此HTGC更适合用于分析相对饱和的TAG。NARP-HPLC法可以实现对具有不同ECN值TAGs的有效分离，但是难以分离具有相同ECN值的TAG，对TAG位置异构体的分离选择性也较差。Ag+色谱可以根据甘油三酯的双键数目、双键位置等因素将ECN值相同的甘油三酯进行分离，是非水反相液相色谱法的有效补充，TAG双键数越多，在Ag+色谱柱上的保留时间越长，串联三根Ag+色谱柱仍无法实现双键数大于7的LC-PUFA TAG位置异构体的分离[61]。将NARP-HPLC和Ag-HPLC两种不同保留机理的分离模式离线或在线联用，构建2D-HPLC分离系统，是实现TAG高选择性分离的有效途径。此外，最近有研究采用无封端聚合ODS柱(Non-endcapped Polymeric ODS，ODS-P)实现了对LC-PUFA TAG位置异构体的分离。

5 LC-PUFAs TAGs的定量手段

5.1 LC-PUFAs TAGs的定量方法

胡珺等[36]研究发现，双键数大于3和小于3的TAG在质谱上的响应有着很大的差别，进而将食用油中的甘油三酯根据不饱和度不同分为两组(不饱和度大于等于3和小于3)，通过选取各组中具有代表性的7种甘油三酯标准品建立标准曲线，最后选取与目标TAGs结构最为相似的标准品所对应的标准曲线对TAGs进行定量分析。该类比标准曲线定量方法有效地克服了不同结构甘油三酯质谱峰响应差别比较大的问题，解决了需要对所有甘油三酯都建立标准曲线以达到其量化的问题。此外，还有少数文献报道了使用响应因子对甘油三酯进行定量分析的方法。Li等[62]在定量拟南芥中TAG时，采用ESI-MS多重中性丢失扫描模式，以相同C数，不同双键数的TAGs以及不同C数，相同双键数的TAGs在质谱上的相对响应因子(设十七碳烯酸三甘油酯的响应因子为1)绘制标准曲线，共定量了拟南芥种子中93个TAGs分子。

5.2 LC-PUFAs TAGs异构体的定量方法

目前主要有三种方法用于定量分析TAG异构体。最早用于定量分析TAGs异构体的方法是利用酶的选择性水解作用。虽然酶对立体定向位置和特定碳链长度脂肪酸的选择性是已知的，但是准确地应用酶的立体选择性依赖于实验条件，通常不能实现直接定量。第二种方法是色谱分离TAGs异构体，联用质谱检测器进行鉴定，但是LC-PUFAs TAG异构体的色谱分离仍是一大难题。第三种方法，液相色谱-串联质谱法，不需要实现对异构体的分离，通过建立不同浓度比的异构体标准品与碎片离子丰度比的标准曲线来进行定量。Herrera等[39]利用LC-ESI-MS3建立多种含EPA和DHA的长链多不饱和脂肪酸甘油酯不同含量比与碎片离子丰度比的标准曲线，成功确定EPA，DHA在鱼油TAG中酰基化位置，实现对实际油脂样品中特定异构体的定量分析。Ramaley等[63]分别将每对LC-PUFAs TAGs酰基位置异构体标准品混合进样，建立异构体浓度百分比与碎片离子丰度比的曲线关系，即检测到的碎片离子丰度比对应为异构体对中一个异构体的浓度百分比，用该方法实现了实际样品中异构体各组分的定量，同时也发现所建立的含有EPA 、DHA 的四对甘油三酯酰基位置异构体的曲线为非线性关系。

6 结论与展望

色谱与质谱技术的迅速发展，已能实现对许多甘油酯的组成及结构的高效、高准确度和高灵敏度的分离鉴定。但对具有较高营养价值，易氧化的长链多不饱和脂肪酸甘油酯的分析仍存在诸多挑战。首先，缺少高纯度的LC-PUFAs TAGs异构体标品，而合成这样的异构体需要花费高额的费用，成为限制其鉴定的主要原因；其次，LC-PUFAs TAGs不饱和度较高，碳链较长，质谱裂解机制复杂，分离鉴定难，进而增加了定量难度。因此对LC-PUFAs TAGs的研究方向包括：建立LC-PUFAs TAGs异构体的合成方法，大力开发和优化各种色谱分析手段与质谱技术的联用，完善快速、高通量、高灵敏度的剖析LC-PUFAs TAGs的方法，并进一步完善定量分析方法。