mir－181c抑制神经母细胞瘤的作用机制研究

李 勇 王莉华

郑州大学附属郑州中心医院 郑州 450007

50%的神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）发生在2 岁以内的婴幼儿。NB预后差别很大，有广泛的肿瘤异质性［1］。低危组NB患者（婴幼儿）临床观察或手术可以取得良好疗效；高危组NB患者即使综合治疗预后仍不佳。NB 属于神经内分泌性肿瘤，超过50%的神经母细胞瘤病人发生转移，尤其骨转移严重威胁儿童的健康［2］。尽管有许多因素与NB发病机制相关［3］，但对关键分子机制和NB终末期决定因素尚未清楚。因此，识别新介质对NB 发病机制非常重要。本课题拟对mir－181c在NB中的调控机制进行探讨。

1 实验步骤

1.1 组织样本和细胞系 12个NB组织从郑州大学附属郑州中心医院神经外科获得。经组织病理学检查确认，并存储在－80液态氮。人类NB细胞系SK－N－SH 和SH－SY5Y 培养在（Eagle＇s Minimum Essential Medium EMEM Gibco），用10%胎牛血清缓冲，补充100 U／mL 青霉素／链霉素（PEST）。所有细胞都保存在5%CO237 ℃湿润孵化器。

1.2 寡核苷酸合成和细胞转染 MiR－181c模块，miR－181c反义寡核苷酸（AOS），模块（mimics－ctrl），ASO 控件（ASOctrl），购买于上海基因制造公司。使用Lipofectamine TM 2 000细胞转染试剂（英杰公司）进行细胞转染。

1.3 RNA 的提取和实时定量PCR 根据制造商的说明方案，使用Trizol提取总的RNA。使用NanDrop ND－1000分光光度计来测定RNA 的浓度和质量。然后使用1μg 的RNA 进行逆转录。对于miRNA 的逆转录反应，使用特定的miR－181cRT 引物，然后用于总RNA 的逆转录，Oligo（dT）作为一个通用的引物，使用SYBR GreenPCR 混合物进行实时定量PCR。条件如下：95℃5min，随后40个循环的95℃30s，57 ℃30s，72 ℃30s。RNU6B（U6 小 核 乙 非 编 码RNA）作为miR－181c正常表达的所有使用的引物如下：miR－181c RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；U6 RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AAAATATGGAAC3’；miR－181cforward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；U6 forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGGTGCTCGCTTCGGCAGCACA 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’。

1.4 肿瘤细胞存活实验（MTT） 铺96孔板，4 000个／每孔转染细胞。转染48h 后，用MTT 培养4h。加入DMSO 100μL，解除MTT 并将细胞放置摇晃10min。用分光光度计测定吸光值A（波长570nm）。细胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.5 集落形成试验（克隆实验） 将转染的细胞接种到12孔板中，密度为200个细胞／孔。将培养液每3d更换1次，孵育10～14d。当大多数克隆含超过50个细胞时，终止孵育。用1×PBS洗脱克隆，冷甲醇固定克隆细胞，结晶紫染色约5min。将克隆进行拍照并计数。集落形成率＝克隆数／接种细胞数×100%。

1.6 Transwell小室迁移试验和侵袭试验 无血清培养基培养24h，消化细胞并离心收集细胞，细胞悬液（细胞密度2.5×104）250μL加入Transwell上室，腔室底部则加入750 μL的含10%～20%血清的培养液。20h后取出Transwell小室，使用棉签轻轻擦拭小室上层细胞，使用4%多聚甲醛固定Transwell小室。取出固定好的小室，使用自来水冲洗小室，结晶紫染色15 min冲洗。将染好色的小室经梯度酒精脱水，风干后取下膜层，用中性树脂封片，显微镜下计数即可。

1.7 统计学分析 运用SPSS 13.0统计学软件，所有数据采用¯x±s表示，2组间比较采用双样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mir－181c抑制NB组织转移 如图1示，mir－181c的表达水平在转移NB组织中表达降低，与原发NB组织中表达水平形成显明对比，表明mir－181c与肿瘤生成有关。

图1 定量RT－PCR分析Mir－181c表达率，＊P＜0.05

图2 mir－181c抑制SK－N－SH 细胞

2.2 mir－181c抑制SK－N－SH 细胞扩散 经RT－PCR 验证了2个细胞系，mir－181c模块或mir－181cASO 转染的SK－NSH 细胞。MTT 分析 显 示，mir－181c可 降 低SK－N－SH 细 胞的活力约20%，而抑制了mir－181c细胞生存能力提高约25%。mir－181c对SH－SY5Y 细胞也有相似的作用。从克隆形成实验我们发现mir－181c的超表达减少SK－N－SH 克隆细胞约50%，而抑制mir－181c表达可导致相反的影响。表明mir－181c可能在肿瘤的生长起重要作用。见图2。

2.3 mir－181c抑制SK－N－SH 和SH－SY5Y 细胞的迁移和入侵 为确定mir－181c是否与肿瘤转移相关，我们采用Transwell检测了mir－181c影响细胞迁移和入侵作用。发现mir－181c超表达减少了迁移和入侵SK－N－SH 细胞数量分别为约40%和50%，而抑制mir－181c起相反效果。图3 显示mir－181c超表达减少了迁移和入侵SH－SY5Y 细胞的数量。表明mir－181c参与了NB的迁移。

图3 mir－181c抑 制SK－N－SH 和SH－SY5Y 细 胞 的 迁移和入侵

3 讨论

研究表明miRNA 参与多种生物过程，包括细胞的分化、增殖和凋亡［4－5］。超过50%的miRNA 拥有与癌基因相结合的脆裂点［6］，到目前为止发现60%的蛋白编码基因受miRNA 的调控［7－8］。研 究 表 明，miRNA 扮 演2 个 角 色（致 癌 基因／抑癌基因），如mir－490－3p作为一个致癌因子促进细胞增殖、迁移和入侵，而且还会靶向作用于ERGIC3导致肝细胞肝癌的上皮间叶细胞转化（EMT）［9］。mir－125b抑制乳腺癌细胞增殖和转移特征通过靶向下调致癌基因ETS1完成［10］。

许多关于miRNA 对NB 组织下调机制的研究报道，但关 于miRNA 对NB 组 织 上 调 机 制 研 究 仍 很 少［11－12］。mir－335通 过调节TGF－β信 号 通 路 抑 制NB 细 胞 入 侵［13］，mir－9通过靶向作用于MMP－14抑制NB 细胞的入侵和迁移［14］。mir－15a通过mir－15a／RECK／MMP－9 轴 促 进NB 细 胞 的 迁移和生长［15］。研究人员在miRNA 对NB 组织的分析过程中发现对神经系统及免疫机制有抑制作用［7］。

NB是儿童常见的实质性恶性肿瘤，可表现为预后多样性，NB病因尚不清楚。研究人员进行了碱基配对改变和重排后与NB有关联基因中发现了癌症特异性基因突变，其中ARID1A 和ARID1B基因突变与患儿病死率有关，而且还发现N－myc基因的扩增突变在NB 中常见，呈双向扩增，发现此扩增方式与肿瘤的扩散相关。研究发现，一些蛋白酶与NB发病有关，在肿瘤生物进程中起重要作用。在鼠体内模型中检测54个与NB有关的miRNA，发现35个上调，下调19个，部分miRNA 在原发NB 和转移NB 中的表达有明显差异，说明这些表达有差异的基因在NB转移中起重要的作用，还发现NB中基质金属蛋白酶14（MMP－14）与肿瘤病理特性及预后生存率密切相关。

MiR－181家族里6个基因，这些miRNAs均由3个独立的染色体编码，并产生4个成熟的miRNA。研究表明，miR－181s在肝细胞肝癌中超表达并参与细胞分化［16］。在肝细胞肝癌中，TGF－β（转化生长因子－β）可通过抑制TIMP3 上调miR－181b，从而促进细胞增殖、迁移和入侵［17］。Mir－181c通过下调BMPR2 而与室中隔缺损有关［18］。胃癌中高表达mir－181c与淋巴结转移和预后有关，表明mir－181c可能是致癌基因［19］。Fanconi贫血中mir－181c具有促进TNF－α克隆潜能作用［20］，表明miR－181家族在包括癌症的很多疾病的发生中起促进作用。

本实验用mir－181c－mmics和AOS－mir－181c转染NB 细胞，MTT 分析显示mir－181c降低细胞活力约20%，colony实验示减少NB细胞克隆约50%，2组间抑制细胞生长率有明显差异，说明mir－181c对NB细胞有抑制作用（图2）。本实验结果表明mir－181c在NB细胞中的新型调控机制，证明mir－181c可能在NB发病机制中起重要作用。相比之下，本研究组织标本中RT－PCR 结果显示，mir－181c在转移NB组织中的表达率明显低于原发NB组织，初步肯定mir－181c与NB转移有关。体外细胞实验发现转染mir－181c－mmic可抑制NB细胞的迁移和侵袭分别约40%和50%（图3），确定本实验中mir－181c是抑癌基因。

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