基于GC-MS的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立

郭刚 唐丹 田萍萍 石秀峰 曹鹏 高强

（天津科技大学生物工程学院　工业发酵微生物教育部重点实验室，天津　300457）

基于GC-MS的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立

郭刚 唐丹 田萍萍 石秀峰 曹鹏 高强

（天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室，天津300457）

基于GC-MS分析平台，建立了阿维链霉菌代谢物组样品制备过程中的菌体分离、细胞清洗、细胞淬灭及代谢物提取条件，并对阿维菌素高产菌株和野生菌株胞内代谢物组进行了初步分析。采用“冷冻离心-细胞清洗（3次）-液氮淬灭（5 min）-珠磨破壁（3个循环，每个循环48 s）-提取（氯仿∶乙醇∶水= 2∶2∶1）”的方法，可以定性和定量检测阿维链霉菌胞内包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类等59种差异化合物。建立的方法能够有效地用于阿维链霉菌胞内代谢物的分析。

阿维链霉菌；代谢物组；破壁；提取；GC-MS

阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的阿维菌素是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素，在医药、农业和畜牧业生产中具有良好的应用价值和广阔的市场前景［1］。国内外学者对阿维链霉菌的高产机制进行了广泛研究［2］，这些研究主要集中在基因水平和蛋白质水平，而对阿维菌素产量低、副产物浓度过高等不利表型关注不多［3-5］。对于外界环境胁迫，细胞具有非常精妙和极其复杂的调控和适应机制，不仅涉及到“上游”基因组、转录组和蛋白质组等水平的变化，还包括“下游”对于外界扰动更加敏感的代谢物、代谢路径和代谢网络等层面的变化［6］。

代谢物组学（Metabolomics/Metabonomics）是对生物体内所有相对分子质量在1 000以内的代谢物进行定性和定量分析［7］，它是继基因组学和蛋白学之后发展起来的组学学科。其着重于全局分析和理解代谢网络与动态调节以及代谢通路控制［8，9］。代谢物组学在定量分析系统生物学中扮演着重要的角色。在这一领域已经建立了气质（GC-MS）、液质（LC-MS）和核磁（NMR）等检测手段［10］。

微生物代谢物组学需要高效可靠的样品前处理，这样才能够确保胞内代谢物分析的准确性［9，11］。然而，最近许多科研工作者未进行条件优化，直接使用文献报道的样本前处理方法。为了确保样品准确反映生物体的特定状态，研究合理有效的胞内代谢物提取方法显得尤为重要。常用的方法是在细胞悬液中加冷甲醇或其他有机溶剂，瞬间停止细胞的代谢［12］。但这个方法的缺点是，在淬灭过程中有机溶剂裂解细胞导致大量胞内代谢物丢失［13］。另一种方法是将菌体从培养基中分离出来之前或之后用液氮进行淬灭［9，13，14］。代谢物提取过程中，提取方法和提取溶剂对提取物的种类和含量有较大的影响。本试验着重研究了细胞分离过程中的细胞清洗次数、破壁方法（液氮研磨和珠磨法）、破壁次数和提取溶剂对代谢物提取的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 阿维链霉菌野生型（WT）和高产菌株（9-39）均由中国科学院微生物研究所提供。培养基和培养方法见文献［15］。

1.1.2 主要试剂 甲氧基铵盐酸盐（色谱纯）与吡啶（色谱纯），天津元立化工有限公司；N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（色谱纯），Alfa Aesar化学有限公司。

1.1.3 仪器与设备 Precellys 24珠磨器，法国Bertin公司；LC/MS气相色谱-质谱联用仪，配有7683自动进样器与6980气相色谱仪（GC，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 菌体制备及淬灭 取20 mL阿维链霉菌发酵液8 000 r/min离心5 min，上清液-80℃冻存，用于后续分析。在离心后的细胞沉淀中加入4℃预冷的0.6% NaCl水溶液，震荡，6 000 r/min、4℃离心5 min，取1 mL上清液-80℃冻存，用于后续分析，弃上层缓冲液保留下层细胞沉淀，反复3次，以去除细胞表面的培养基成分［16］。将清洗后的细胞置于液氮中，淬灭5 min，-80℃保存备用。

1.2.2 细胞破碎和胞内小分子提取

1.2.2.1 液氮研磨细胞破碎 将淬灭后的细胞液氮研磨20 min，至细粉状，称取50 mg于1.5 mL离心管中用于小分子代谢物的提取，每个取样点取5个平行［17］。

1.2.2.2 珠磨法细胞破碎 将含有50 mg淬灭后细胞的离心管中加入1.5 g玻璃微晶，再加入1 mL预冷的提取液，混匀后珠磨处理1-3个循环（每个循环48 s），液氮冻融，每次冻2 min，重复4次，4℃、10 000 r/min离心5 min，保留上清于新的离心管中。

1.2.2.3 胞内小分子提取 液氮研磨后的样品加入1 mL预冷的提取溶剂（60%冷乙醇溶液；4∶6的1 mmol/L富马酸水溶液：甲醇；2∶2∶1（V/V）的氯仿∶乙醇∶水；60%沸乙醇［12，18］；60%冷甲醇溶液），涡旋1 min至匀，液氮冻融，每次冻2 min，重复4次［19］。热乙醇法提取：60%乙醇置于沸水浴10 min，取1 mL加入含有50 mg菌体的EP管中沸水浴5 min。细胞提取液10 000 r/min离心5 min，保留上清于新的离心管中。

1.2.3 样品的衍生化 将上述提取液冷冻干燥后，加50 μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解样品，置于40℃水浴中，反应80 min；（2）加80 μL N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，混合均匀，置于40℃水浴中，反应80 min；（3）将衍生后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2 h，准备进行GC-MS检测。

1.2.4 GC/MS检 测 GC条 件［17］：Agilent HP5 30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱；进样口温度：280℃，升温程序：初始温度70℃保持2 min，以5℃/min程序升温至290℃保持5 min；载气：高纯氦气，恒压模式91 kPa，流速1 mL/min；进样量1 μL；柱后分流比10∶1。

MS条件［17］：接口温度：280℃；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：250℃；电子轰击能量：70 eV；电子电流：40 μA；扫描质量范围：50-800 m/z。

1.2.5 数据处理 将GC/MS数据导入MSD增强型化学工作站，提取离子峰并用NIST08数据库进行比对进行定性，通过将所有的离子峰与内标物质的峰面积相比使数据归一化，再对数据进行中心化后导入SIMCA软件进行PCA分析［7，20］。

2 结果

2.1 菌体清洗

代谢物组研究过程中样品的制备是非常重要的，胞内代谢物组的研究过程中必须清洗菌体去除培养基成分。但细胞清洗过程中也存在胞内物质泄漏。因此选择合适的清洗剂和恰当的清洗次数非常重要。为了确定最恰当的清洗次数，GC-MS测定发酵液上清和4步清洗后的上清液。结果发现3步清洗可以将胞外代谢物和培养基成分完全去除（图1）。

图1 菌体清洗效率

2.2 细胞破碎

阿维链霉菌属于革兰氏阳性菌，使用有机溶剂无法将其细胞壁有效破碎，因此在提取胞内物质之前需要通过必要的机械方法来破坏细胞壁。液氮研磨法和珠磨法是常用的细胞膜破碎方法，这两种方法可以在不引入其他物质的前提下达到破碎的目的。

本研究分别利用这两种破壁方法提取胞内物质，GC-MS检测胞内成分，数据经过归一化和标准化导入SIMCA进行PCA分析（图2）。从得分图（图2-A）中可以看出液氮研磨法和珠磨法提取的胞内物质存在明显的差别，液氮研磨法在得分图中比较分散，说明液氮研磨法组内误差较大，这主要是由于人工研磨样品不均一所致。从得分图（图2-B）对应的载荷图中可以看出，液氮研磨法和珠磨法主要的差别体现在17种物质的提取效率上，对比这17种物质相对峰值（图3）可知，珠磨法提取的物质相对量远大于液氮研磨法。

代谢物组研究过程中胞内物质的提取过程严重影响代谢分析的结果，为了研究珠磨法破壁效率，GC/MS测定珠磨1-3个循环的胞内提取物并进行PCA分析，将引起差异的主要物质进行比较，结果（图4）发现随着珠磨次数的增加，提取的胞内物质的量增加，但到3个循环时有部分物质的提取量下降，因此确定珠磨两个循环为最优。

2.3 胞内代谢提取

代谢物组数据分析过程中，需要定性和定量尽可能多的物质来全面的描述代谢途径、代谢调节及描述机制。阿维链霉菌胞内代谢产物GC/MS可检测到的多达300多种，而这些物质在同一溶剂中的溶解度不同。合适的萃提溶剂要求在提取过程中不能对代谢物进行物理或者化学修饰，而且要尽可能多的提取代谢物。因此进行试验和比较不同的提取剂对阿维链霉菌的胞内代谢产物的提取是非常必要的。试验中比较的5种溶剂，见表1。

编号　　溶剂组成A 60%冷乙醇溶液B 1 mmol/L富马酸水溶液：甲醇=4∶6 C氯仿∶乙醇∶水 = 2∶2∶1 D 60%沸乙醇E 60%冷甲醇

通过以上各种提取溶剂对阿维链霉菌代谢物的比较（图5）可以明显看出提取液C除了有3个相对峰值（乳酸、脯氨酸、亮氨酸）低于60%冷甲醇提取，其他峰值均明显高于对照，因此2∶2∶1（V/V）的氯仿∶乙醇∶水更适合作为阿维链霉菌胞内代谢物组的提取溶剂。

2.4 阿维链霉菌代谢物组分析

在建立了链霉菌代谢物组学研究方法后，为解析阿维链霉菌高产阿维菌素的机制，本研究对阿维链霉菌野生型（WT）和高产型（9-39）代谢物组进行了分析。

通过得分图（图6-A）可以看出WT和9-39胞内代谢物存在明显的代谢差异。从载荷图（图6-B）可知，阿维链霉菌培养到第10天，9-39与WT胞内物质的主要差异来自糖类和部分氨基酸，9-39胞内半乳糖、葡萄糖和纤维二糖水平高于WT，这与蛋白组学研究结果相一致［21］。此外，蛋白组学研究发现阿维链霉菌高产菌株的糖代谢相关酶表达量高于野生菌株。本研究中高产菌株氨基酸类中的亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸与赖氨酸代谢水平较高，这也与蛋白组学相关结果一致［21］。

图2 液氮研磨法与珠磨法细胞破碎提取物PCA分析得分图（A）和载荷图（B）

图3 液氮研磨法和珠磨法细胞壁破碎效率的比较

图4 珠磨循环对胞内物质提取效率的影响

图5 不同提取溶剂对提取效果的影响

3 讨论

阿维链霉菌作为阿维菌素的生产菌株，其代谢工程与合成生物学改造对进一步提高阿维菌素产量具有重要意义。在改造过程中，代谢物组学作为一种系统的研究手段，在目的产物相关代谢物的发现中具有无与伦比的优势。近年来，在微生物代谢物组学研究方面取得了巨大的进步，但尚无阿维链霉菌代谢组学研究方法的文献报道，而现存的代谢物组学研究方法中没有一种可以适用于所有微生物。这就要求人们在制备准确反映细胞生理状态的代谢物时，不能采用与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等相同的方法。所以本研究主要对阿维链霉菌代谢物样品制备步骤进行了系统优化。

细胞清洗能够去除培养基和胞外代谢物对胞内代谢物组的影响。由于胞外代谢物和培养基成分复杂，清洗不完整会严重影响胞内代谢物组的测定，而清洗过度会导致细胞壁受损严重，胞内代谢物大量渗漏，致使获得的代谢物数目显著减少。通过研究发现，细胞清洗3次能够在不导致细胞破裂的情况下完全去除培养基和胞外物质。液氮反复冻融是提取胞内代谢物的主要方法，但对于具有较厚细胞壁的革兰氏阳性细菌及真菌，反复冻融法通常不能充分提取其胞内代谢物。为了解决这一问题，本实验室研究液氮研磨和珠磨法这两种破碎细胞壁的方法发现，珠磨法比液氮研磨法能够有效地破碎细胞壁。此外，研究还发现珠磨两个循环可以充分提取胞内物质。代谢物组数据分析过程中，需要定性和定量尽可能多的物质来全面的描述代谢途径、代谢调节及描述机制。由于代谢物在不同的提取溶剂中的提取效率不同，本研究比较了5种提取溶剂的提取效率，结果发现用甲醇∶氯仿∶水 = 2∶2∶1（V/V）的比例提取的胞内的代谢物质最全面，而且提取含量最高。通过对各样品制备环节进行比较优化，最终得到了最适合阿维链霉菌代谢物分析样品的制备方法。

图6 阿维链霉菌胞内代谢物PCA分析得分图（A）和载荷图（B）

4 结论

利用本试验室建立的阿维链霉菌代谢物组学样品制备方法，对阿维菌素高产菌株（9-39）和野生菌株（WT）代谢物相对强度进行了分析，高产菌株的糖代谢和部分氨基酸代谢旺盛，这与蛋白组学研究的结果相吻合。因此本试验室建立的代谢物提取分析方法适用于阿维链霉菌代谢物组研究。

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（责任编辑 狄艳红）

Optimized Sample Preparation for Metabolome Studies on Streptomyces avermitilis by GC-MS

Guo Gang Tang Dan Tian Pingping Shi Xiufeng Cao Peng Gao Qiang
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin300457）

We established a method for preparing metabolome sample of Streptomyces avermitilis， including cell separation， washing，quenching， disruption and extraction conditions based on GC-MS analysis system， and applied it in the analysis of the metabolome of industrial strain 9-39 and wild type strain. The optimal conditions for sample preparation were as follows: separating cells by centrifugation， washing 3 times， quenching 5 minutes with liquid nitrogen， cell disruption with bead mill（3 cycles and 48 seconds per each cycle）， and extraction of metabolites（chloroform∶ethanol∶water = 2∶2∶1）. By using this optimized protocol， 59 differential compounds were identified and quantified， including amino acids， organic acids， fatty acids and saccharides. Our established method can be used to effectively analyze the Streptomyces avermitilis metabolites.

Streptomyces avermitilis；metabolomics；cell disruption；extraction；GC-MS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.010

2014-09-24

国家“973”项目（2013CB734004），国家“863”项目（2012AA021302），国家自然科学基金项目（31370075，31471725）

郭刚，男，硕士研究生，研究方向：生物制药；E-mail：guogangx@163.com

高强，男，教授，研究方向：代谢控制发酵；E-mail：gaoqiang@tust.edu.cn