猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测与分析

张　志，张美晶，董雅琴，王　佳，吴发兴，刘　爽，邵卫星，李晓成，王树双

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032）

猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测与分析

张志，张美晶，董雅琴，王佳，吴发兴，刘爽，邵卫星，李晓成，王树双

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

为调查我国猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的污染情况，本文用巢式RT-PCR方法检测了部分蓝耳病弱毒疫苗和猪瘟细胞苗中的牛病毒性腹泻病毒，并分析其核酸序列的遗传特性，结果共检测出9份BVDV阳性样品，分子遗传分析表明污染的牛病毒性腹泻病毒分别属于BVDV的1a型和1b型。

牛病毒性腹泻病毒；PCR；猪瘟；猪蓝耳病；疫苗

我国的生猪产量占世界总产量的50%以上，但同时我国养猪场的猪病也极为复杂，猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪流行性腹泻等疫病广为流行。目前我国猪群重大疫病的防控主要依赖疫苗免疫，因此疫苗的质量高低就直接关系到我国生猪产业的发展。猪用商品化疫苗以弱毒疫苗为主。弱毒疫苗具有可诱导体液和细胞双重免疫、只接种一次即可起到良好的预防效果、持续时间长、不需佐剂等优点。但是，弱毒疫苗的使用可能导致如下问题：易受外源病毒污染、发生交叉感染、有毒力残留等。疫苗一旦被污染以后，不仅疫苗使用效价降低，起不到预防和控制传染病的功效，甚至还会造成疾病的传播。

我国猪用弱毒疫苗中，屡有外源病原污染情况，常见污染源为支原体和牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）［1］。牛病毒性腹泻病毒自首次被报道以来，在全世界很多畜牧业发达国家中流行［2］，如：澳大利亚、德国等国家猪群中BVDV抗体阳性率达3%～40%，荷兰达15%～20%。各种年龄的牛都可感染牛病毒性腹泻，以幼龄牛易感性最高，在垂直传播后，会产生病毒血症［3］。以含BVDV的血清作为原料时，就会污染制备的生物制品，如猪瘟细胞苗生产过程中会使用到牛睾丸细胞以及牛血清；蓝耳病疫苗（尤其是弱毒疫苗）生产工艺中在传代细胞培养中会使用到牛血清，如果血清材料含有BVDV病原或抗体，会使猪瘟细胞苗和蓝耳病疫苗污染［3-4］。猪瘟活疫苗BVDV污染在我国早已有报道［5］，但近年来，我国猪瘟细胞苗和猪蓝耳病弱毒疫苗生产厂家都有数十家之多，若不能及时监测出疫苗中BVDV污染情况，会造成重大经济损失甚至会导致传染病的流行。因此，对猪瘟和蓝耳病疫苗受BVDV污染情况的监测与分析十分有必要。本文拟采用套式RT-PCR方法对CSF和PRRS弱毒疫苗污染BVDV情况进行检测与分析，这对指导畜牧业生产中科学使用疫苗有重要的意义。

1　材料与方法

1.1疫苗

猪瘟细胞苗和猪蓝耳病弱毒疫苗为14个省份送来的招标疫苗。这些疫苗每只用5 mL 0.01M的灭菌PBS溶解后，备用。

1.2试验试剂

RNA提取试剂Trizol，购自Іnvitrogen公司；RT-PCR Kit，购自大连宝生物公司。

1.3RNA提取

取稀释的疫苗250 μL加入750 μL Trizol，振荡混匀后，室温放置5 min，加入氯仿250 μL，剧烈振荡后，室温放置10 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取500 μL上清，加入等量异丙醇，混匀，-80℃沉淀30 min后4℃ 12 000 r/min离心10 min，去上清，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗涤，4℃ 12 000 r/min离心5 min弃上清，室温干燥RNA沉淀20 min，加入30 μL DEPC水，充分溶解后-80℃冻存备用。

1.4巢式RT-PCR扩增

［6］建立的巢氏PCR方法，设计合成了2对引物，用于巢式RT-PCR扩增，引物序列位于BVDV的NS5B基因，详见表1。

第一次扩增的反应体系为：Enzyme Mix 1 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，P1（20 μM）0.5 μL，P2（20 μM）0.5 μL，RNA 3 μL，DEPC水7.5 μL，反应总体积为25 μL。反应条件为：50℃反转录30 min；94℃预变性5 min；94℃变性30s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。第二次扩增时取第一次PCR产物作为模板，反应体系为：Ex-Taq 0.5 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，P3（20 μM）0.5 μL，P4（20 μM）0.5 μL，一扩PCR产物2 μL，DEPC水9 μL，反应总体积为25 μL。反应程序为：94℃预变性3min；94 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，33个循环；最后72 ℃延伸7 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳观察，选择出现特异性条带的样品送至上海生工公司进行测序。

1.5序列分析

从GenBank上下载BVDV相关的参考毒株，共20株（表2），分别来自日本、美国、加拿大、中国等的不同的基因型，序列分析采用DNAStar、CLUSTAL1.83和MEGA6.06软件，分析疫苗中污染的BVDV毒株的核苷酸同源性，并绘制了NS5B基因序列的系统进化树。

2　结果

2.1巢式PCR扩增结果

以疫苗提取的RNA为模板，采用P1、P2引物进行RT-PCR的产物再以P3、P引物巢式PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，发现猪蓝耳病弱毒疫苗中有6个样品为阳性（样品编号为BVDV16，BVDV17，BVDV18，BVDV19，BVDV20和BVDV21），猪瘟细胞苗有3份为阳性（编号为BVDV26，BVDV27和BVDV30），详见图1和图2。

表1　BVDV扩增的引物

表2 BVDV参考序列

图1 猪蓝耳病疫苗BVDV 巢式扩增结果

图2 猪瘟细胞苗BVDV 巢式扩增结果

图3　BVDV不同毒株的进化树分析

2.2进化树分析

将这9份阳性样品测序后进行BLAST分析发现，这9份样品全部为BVDV毒株，进一步与BVDV参考毒株进行进化树分析发现，这些BVDV可以分为BVDV 1型和2型两个进化分支，其中BVDV 1型为优势分支，它又可以分为1a和1b两个亚型，1a为参考毒株或经典毒株的进化分支。本文检测的9株BVDV中，来自猪瘟疫苗的3个毒株BVDV-26、27、30和来自猪蓝耳病疫苗的BVDV-17、18、19均属于1a分支，而另外3个来自猪蓝耳病疫苗的BVDV16、20、21属于1b分支（图3），并且来自猪瘟疫苗的BVDV19和来自猪蓝耳病疫苗的BVDV27位于同一个更小的进化分支内，这提示二者可能有共同的来源。

2.3同源性比较

本文从疫苗中所测的9株BVDV污染毒株之间的同源性为80.7%～99.4%，其中，BVDV-26和BVDV-30毒株之间的同源性最高，为99.4%，BVDV-20和BVDV-30毒株之间的同源性最低，仅为80.7%。9株BVDV与参考株NC_001461的同源性为82.8%-86.8%，与其他BVDV 1型毒株的同 源 性 为78.8%～96.0%，与BVDV 2型毒株的同源性为69.6%～76.8%，与外类群HCLV-AF091507的同源性为68.9%～73.0%（图4）。

3　讨论

BVDV是疫苗中常见的一种污染源，由于BVDV毒株在细胞上难以产生明显的细胞病变，因此PCR方法就成为最常用的BVDV检测方法［1］。考虑到BVDV与CSFV和BDV均属于黄病毒属，三者在基因组上的同源性较高，常规的PCR扩增容易因交叉反应而产生假阳性结果，为保证检测结果的准确性和特异性，本文在试验前首先对国内外PCR检测方法进行了筛选比较，最后确定采用NS5B区的一段保守序列进行扩增的套式引物，该引物可以有效区分BVDV和CSFV，同时具有较高的灵敏度［6］。本文的检测结果也充分表明了该检测方法的可行性和有效性。

图4　BVDV各毒株的同源性比较结果

近年来，一些学者对疫苗中的外源病原污染进行了研究，2008年，范学政等［5］报道猪瘟疫苗中BVDV的感染率为21.74%；2011年，叶兆美等［7］对四川市售的猪蓝耳病疫苗和猪瘟疫苗进行了检测，结果10份猪瘟疫苗和9份猪蓝耳病疫苗中BVDV的污染率为10.53%；2011年，范仲鑫等［8］对湖南省内的48个批次的猪瘟疫苗进行了BVDV检测，阳性率为18.75%。这些检测结果提示我国猪用疫苗中BVDV的污染较为严重。

从本次猪蓝耳病疫苗和猪瘟疫苗中检测BVDV的基因型来看，6株为1a型，3株为1b型，这一结果与牛群中BVDV的血清型分布类似［2，9］，提示这些疫苗中的BVDV污染很可能来自牛血清中的BVDV持续性感染所致。因此，要进一步加强血清的检测和监管，避免带毒血清流入市场。

参考文献：

［1］毛晓娜，繆芬芳，季伟.牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的污染情况及检测方法的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2013，40（2）：175-179.

［2］邓宇.我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究［D］.雅安：四川农业大学，2012.

［3］朱礼倩，周艳君，于海，等. 牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析［J］. 中国动物传染病学报，2011，19（5）： 83-86.

［4］宋永峰，张志，张燕霞，等. 猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探［J］. 中国动物检疫，2008，25（7）：25-27.

［5］范学政，宁宜宝，王琴，等.用RT-PCR方法检测检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒［J］.中国兽医杂志，2010，46（1）：8-10.

［6］朱紫祥，顾立伟，张志，等.猪源牛病毒性腹泻病毒PCR检测方法的建立及NS5b区基因序列分析［C］//中国畜牧协会.《2010中国猪业进展》论文集. 北京：中国畜牧协会，2010.

［7］叶兆美.猪瘟和蓝耳疫苗中BVDV和PCV污染情况调查［J］.四川畜牧兽医，2012，39（3）：31-33.

［8］范仲鑫，张朝阳，刘道新，等.猪瘟细胞苗污染牛病毒性腹泻病毒情况调查［J］.畜牧与兽医，2011，43（7）：84-85.

［9］王建领，付彤，刘杰，等. 牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展［J］. 河南农业科学，2012，41（3）：7-11.

（责任编辑：胡藕祥）

Detection and Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus Contamination in Classical Swine Fever and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccines

Zhang Zhi，Zhang Meijing，Dong Yaqin，Wang Jia，Wu Faxing，Liu Shuang，Shao Weixing，Li Xiaocheng，Wang Shushuang
（ China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

To investigate BVDV contamination in classical swine fever （CSF） and porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS） vaccines，vaccine samples were collected and detected by nest RT-PCR for BVDV，resulting in 9 positive BVDV-contaminated vaccine samples. The contaminating BVDVs were identified as BVDV type 1a and 1b.

bovine viral diarrhea virus；PCR；classical swine fever；porcine reproductive and respiratory syndrome；vaccine

S859.79+7

A

1005-944X（2015）11-0076-04

科技基础性工作专项（2012FY111000）；青岛市民生计划项目（13-1-3-91-nsh）

李晓成