猪瘟活疫苗耐热保护剂冷冻干燥技术研究

王春伟，叶胜丹

（浙江诺倍威生物技术有限公司，浙江杭州　310018 ）

猪瘟活疫苗耐热保护剂冷冻干燥技术研究

王春伟，叶胜丹

（浙江诺倍威生物技术有限公司，浙江杭州310018 ）

随着猪瘟活疫苗耐热保护剂的不断应用，冻干技术的要求也越来越高。通过对冻干工艺的不断研究，采取预冻阶段快速和慢速降温，一期升华阶段选取不同温度等方法，筛选一条合适的冻干曲线，不仅缩短冻干时间，降低生产能耗，而且有利产品质量稳定，为今后耐热保护剂的冷冻干燥提供了研究方向。

冷冻干燥；猪瘟活疫苗；耐热保护剂；冻干曲线

我国于1955年成功研制了猪瘟兔化弱毒疫苗，并于1958年成功研制出了冻干疫苗，以适用于批量生产［1］。在兽用生物制品冷冻干燥过程中不仅需要一定量的抗原，而且还需要添加一些成分作为冻干保护剂。冻干保护剂不仅要具有保护制品生物学活性的作用，而且要具有维持制品有一定形状、抗氧化的作用，其直接与疫苗的质量和长期保存保持稳定性相关联［2］。我国现在常用的兽医生物制品保护剂主要用脱脂奶粉和蔗糖进行配制，制品要求低温保存（-15℃以下），2～8℃仅存3～6 个月，因此非常不利于产品的使用和保存［3］。为了克服猪瘟活疫苗常规冻干保护剂存在的不耐热、贮藏温度低、保存期短等缺点，现市场较多企业推出猪瘟活疫苗（脾淋源）耐热冻干保护剂，这大大提高了对冷冻干燥技术的要求。我们也多次进行了相同耐热保护剂不同冻干曲线6次试验，分别标记为S1组、S2组、S3组、S4组、S5组、S6组，不断对冻干曲线进行改进和优化，从中筛选出了1 条适合当前耐热保护剂的最佳冻干曲线。

1　材料与方法

1.1设备性能与材料

1.1.1冻干机性能。东富龙Lyo-1型1m2 冻干机，各项指标达到出厂时要求即可。

1.1.2冻干材料。猪瘟兔化弱毒株从中国兽医药品监察所购买，用家兔继代，脾淋组织毒对家兔的最小感染量为≤10-5/mL。选择定型热和轻型热反应兔，从体温下降及其以后的24 h内剖杀，以无菌手术采取脾脏和肠系膜淋巴结，置于-15℃以下保存备用［4］。耐热保护剂成分以2%明胶、5%蔗糖、2%聚乙烯吡咯烷酮为基础，均有由美国Sigma公司生产。对照组采用常规5%蔗糖脱脂奶粉保护剂。

1.2方法

1.2.1要求。要求试验产品和对照组产品均使用相同批次的组织毒，配苗比例完全一致。

1.2.1.1试验组苗配制。在百级洁净环境下，将采取的脾淋组织先研磨、再用80目铜纱网进行过滤，去除残渣，与耐热保护剂混合均匀后定量分装，根据文献［4］的要求，每头份脾淋苗不少于组织毒0.01 g，每瓶2.0 mL，每批疫苗配制100瓶左右。

1.2.1.2对照组苗配制。按以上同样方法将家兔脾淋组织毒进行研磨，然后用80目铜纱网进行过滤，再添加5%蔗糖脱脂奶粉保护剂，每头份脾淋苗不少于组织毒0.01 g，每瓶2.0 mL，每批疫苗配制100瓶左右。

1.2.2冻干。将6组试验连同对照组一起采用常温入箱，预冻要求、降温速率、升华温度（表1），至板层温度降至-45℃时控制在此温度，待制品接近该温度，开始计时并保持2 h，目的是使所有制品温度降至共晶点以下，待制品接近升华温度该温度后，可判断结束一期升华。

解析干燥使板层温度控制在25℃保持5 h，或短暂关闭中隔阀观察真空上升速率达到设计要求，方可判断冻干结束，压塞释放真空，结束该批次冻干（图1）。

1.2.3成品检验。冻干后成品按照文献的要求［4］进行无菌检验、真空度测定、物理性状、剩余水分以及效力检验。

1.2.4耐老化稳定性试验。将检验合格的制品置于37℃作耐老化试验，分别保存7天和10天，然后进行相关检验。

表1　6组试验曲线表

图1　冻干曲线图

2　结果

2.1冻干后成品检验

6组试验连同对照样品在冻干结束后，分别取样进行编号，按照文献规定，选用同一批试验用兔，对其进行检验，各项指标必须都要符合文献的要求。

2.2无菌及真空度检验结果

表2 各批次无菌及真空度检验

2.337℃保存下的物理性状及剩余水分测定结果

根据要求将冻后制品放置37℃，分别为7天、10天，后取样进行物理性状和水分含量检测。其中S4组试验、S5组试验和S6组试验产品均出现干缩情况，而且水分超标，不符合规程要求，其它样品全部合格（表3）。

2.437℃保存不同时间效力测定结果

37℃放置7天、10天后进行效力检测，除S4、S5、S6组试验出现干缩情况未进行检测外，其它各组耐热保护剂的效力检测均符合要求，但是5%蔗糖脱脂奶粉的对照均达不到要求（表4）。

表3 在37℃条件下疫苗物理性状与水分含量变化

表4　37℃保存不同时间效力测定结果

3　讨论

3.1预冻降温速率

根据制品保护剂组分，结合产品的特点，在允许的条件下采取快速降温的办法，这样可使冰晶快速形成，产生较大的冰核，有利于水分的快速蒸发。

3.2一期升化温度

通过测到的共晶点使制品温度低于10℃以下保温2小时，在关键的一期升华阶段，一定控制好板层温度，不可使升华界面温度超过共晶点温度，否则就会出现制品塌陷，冻后会发现干缩情况。

综上所述，我们认为耐热保护剂在冻干过程中需要根据保护剂的不同组分，进行冻干曲线的合理调整。前期测量出制品的共晶点，在一期升华温度相同的情况下，预冻降温速率对制品冻型就显得尤其重要。因为制品在预冻阶段，冰晶形成的快慢，对升华时水分子逃逸的空间起着关键性的影响作用。不断调整试验，对冻干曲线进行改进和优化，最终筛选一条合适的冻干曲线，缩短了产品冻干时间，降低了生产能耗，而且有利于产品质量的稳定，对我们今后耐热保护剂的冷冻干燥研究具有重大意义。

［1］ 姜平.兽医生物制品学［M］.第二版.北京：中国农业出版社，2003：252.

［2］ 王玉琳，曾鸣，王玲，等. 病毒活疫苗冻干保护剂筛选研究［J］. 微生物学免疫学进展，1996，24（1）：22.

［3］ 王文成. 兽医生物制品耐热冻干保护剂的研究进展［J］.畜牧兽医科技信息，2002（12）：7.

［4］ 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版［S］.北京：化学工业出版社，2000.

（责任编辑：胡藕祥）

Study on Freeze-drying Technology of Heat Protection Agent of Live Classical Swine Fever Vaccine

Wang Chunwei，Ye Shengdan
（Zhejiang Ebvac Biotech Co. Ltd，Hangzhou，Zhejiang 310018）

With continuous application of swine fever live vaccine heat-resisting protective agents，the freeze-drying requirements are getting higher and higher. Through studies of the freeze drying processes，a suitable freeze-drying curve was selected： applying rapid and slow cooling in pre-freezing stage and selecting different temperatures during first sublimation stage，resulting in not only shortening the drying time，but reducing energy. The study provide the research direction of freeze-drying with heat-resisting protective agents in future.

freeze-drying；live classical swine fever vaccine；heat protection agent；freeze drying curve

S859.79+7

A

1005-944X（2015）11-0084-03